[发明专利]一种氧化磷酸化通路缺陷的DBA细胞模型及其构建方法

说明书

本发明公开了一种氧化磷酸化通路缺陷的DBA细胞模型及其构建方法，属于细胞模型构造技术领域。该构建方法包括在红系诱导分化体系中抑制线粒体氧化磷酸化通路的步骤。具体包括以下步骤：对HPCs进行扩增培养；对步骤(1)所得细胞向红系方向进行定向诱导分化，在分化体系中加入氧化磷酸化通路抑制剂，连续培养，即获得所述氧化磷酸化通路缺陷的DBA细胞模型。本发明所建立的DBA细胞模型可用于进一步挖掘DBA的其他遗传学异常。该模型不需要实验动物参与，成本低、操作简便、建模周期短、可重复性高，可以简单快速开展相关实验研究，以及分析药物的治疗贫血功效，有利于贫血药物的研发。

技术领域

本发明属于细胞模型构造技术领域，具体涉及一种氧化磷酸化通路缺陷的DBA细胞模型及其构建方法。

背景技术

先天性纯红细胞再生障碍性贫血(Diamond-Blackfan anemia，DBA)是一种罕见的以红系造血衰竭为特点的先天性骨髓衰竭综合征。红细胞发育不良是患者主要的血液学特征，主要表现为大红细胞贫血、红系祖细胞减少、网织红细胞减少、部分患者红细胞内腺苷脱氨酸酶明显上升、血清促红细胞生成素升高等特征。此外，还有约50％的患者伴有不同程度的身材矮小、颅面畸形等身体缺陷，并伴有恶性肿瘤易感性增高的风险。临床上，糖皮质激素治疗是该疾病的首选治疗方案，其他可行的治疗方案还有输血。造血干细胞移植是当前唯一可以治愈DBA的治疗手段，但寻找合适的配型仍有相当大的难度。现在最主要的临床问题是，不同的DBA患者对糖皮质激素(比如泼尼松)的敏感程度差异很大，部分患者需要持续用药，而部分患者对药物完全没有反应，且部分患者长时间用药后易于出现感染并发症和铁过载的问题，这可能是由于不同致病因素的DBA患者间的异质性决定的。

DBA的发病主要与核糖体蛋白(Ribosomal Proteins，RPs)基因的杂合突变或大片段缺失有关，DBA也被成为核糖体疾病。在DBA中核糖体蛋白基因的杂合突变导致其基因单一拷贝丧失功能，突变的核糖体蛋白不能聚集在核糖体的任何特定区域。单倍体剂量不足或RPs表达水平的降低，导致了核糖体亚基合成及核糖体RNA前体加工的异常。p53通路的激活是主要的DBA病理机制之一。由于RPs基因的突变，DBA细胞中核糖体生物合成异常并导致了Rpl5和Rpl11的释放并结合到MDM2上，由于MDM2是p53的负调控物，从而激活p53活性。由于红系祖细胞对p53激活高度敏感，导致了细胞周期停滞与凋亡，并最终导致红系造血失败。除p53通路外，Heme合成通路也与DBA有关。DBA病理条件下，Heme生物合成速度快于珠蛋白翻译起始速度，过量的Heme和活性氧导致了珠蛋白合成及红系祖细胞减少。通过添加Heme生物合成的抑制剂琥珀酰丙酮减缓其合成速度，红系造血缺陷表型明显改善。mTOR通路被指参与调控了DBA中mRNA翻译过程。利用全基因组或外显子组测序鉴定新的DBA致病基因是该领域的一个重要研究方向，但仍有约35％的DBA患者尚未检测到相关的遗传学异常。因此，寻找其他作用途径进一步挖掘DBA的遗传学异常以及精准用药是当前缓解临床问题的研究重点。

目前，已有不少研究利用不同的细胞与动物模型对因RPS缺陷导致的致病机理进行研究。比如，通过构建RPS19敲除的脐血CD34⁺的细胞模型，Elena Bibikova等发现RPS19缺失导致GATA1的显著降低，通过抑制TNFα后GATA1的水平部分恢复，红系造血缺陷表型得以改善，发现了RPS19通过GATA1调控红系造血的分子机制；利用小鼠成红细胞模型，Rastislav Horos等也鉴定了对Rps19突变敏感的翻译起始转录本Bag1和Csde1，并验证了其特异性调控红细胞分化的功能；动物模型方面，也是针对RPS缺陷的小鼠模型或斑马鱼模型，如最早构建的Rps19纯合突变小鼠、以及利用转基因技术构建可诱导RPS19缺失的小鼠等，来模拟人类的DBA疾病表型。

以上模型无论是细胞模型还是动物模型，均是针对RPS基因进行研究，提供的信息有限。尚未有模型是针对线粒体氧化磷酸化通路进行构建的，现阶段有关模型仍然单一匮乏，有鉴于此，本发明建立因氧化磷酸化通路异常而导致DBA发生的细胞或动物模型，以模拟DBA的病理特征。

发明内容