[发明专利]基于RAA技术检测I群4型禽腺病毒的引物探针组合及试剂盒

说明书

本发明公开一种基于RAA技术检测I群4型禽腺病毒的引物探针组合及试剂盒，所述引物探针组合中的引物和探针是以I群4型禽腺病毒特异性Hexon基因为目的基因进行设计获得，所述引物探针组合应用在基于RAA技术检测I群4型禽腺病毒的检测中。本发明中引物探针组合的设计实现了I群4型禽腺病毒能够通过RAA技术进行快速、准确的检测，弥补了现有传统检测技术的不足，非常适用于现场快速检测，与传统PCR法相比，RAA法是在恒温下反应，操作简单，摆脱了复杂仪器的束缚，不需变温，大大缩短了反应时间。

技术领域

本发明涉及I群4型禽腺病毒检测技术领域，具体地说涉及一种基于RAA技术检测I群4型禽腺病毒的引物探针组合及试剂盒。

背景技术

禽腺病毒是全球家禽和野禽常见的传染病病原体。多数禽腺病毒可在健康禽体内复制，症状非常轻微或不表现感染症状，在混合感染时，禽腺病毒可成为条件性病原。有时禽腺病毒作为原发病原，可引起火鸡出血性肠炎，鹌鹑支气管炎和产蛋下降综合征等。Ⅰ群禽腺病毒中有A、B、C、D、E 5个种，12个血清型。大多数Ⅰ群禽腺病毒的致病性还未完全明确，不同血清型的致病性有较大差异。较为清楚的是鸡包涵体肝炎（IBH）、心包积液综合征（HPS）和肌胃炎等，很多血清型的毒株都可以引起鸡包涵体肝炎，可是引起心包积液综合征的毒株主要是致病性相对较强的血清4型毒株。

心包积液综合征于1987年在巴基斯坦卡拉奇附近一个叫安卡拉的小镇发生和报道，因此该病被称作安卡拉病。在剖检中发现发生心包积液综合症的心脏很像剥皮后的荔枝，因此也叫做荔枝心脏病。之后，该病逐渐在巴基斯坦、印度、伊朗、伊拉克、阿富汗、土耳其等国家流行，随后又在欧洲、俄罗斯、朝鲜、韩国、日本，美国、秘鲁和智利也有报道和记载。2010年山东某肉鸡场发生了FADV-8b（IBH）引起的包涵体感染，随后在山东、江苏、北京、辽宁、黑龙江、吉林等省份的白羽肉鸡和父母代种鸡群陆续发现此病。2012年江苏省某蛋鸡场发生了FADV-4引起的心包积液综合症（HPS）。2013年后该病在全国十多个省市广泛流行，蛋鸡、麻鸡以心包积液综合症为主，白羽肉鸡和父母代种鸡以包涵体肝炎为主。2016年发病区域有扩散趋势。目前关于该病毒的研究主要围绕形态学、致病性、基因序列分析等，还没有一种准确、快速的检测方法。

针对上述问题，特提出本发明。

发明内容

针对现有技术的种种不足，为了解决上述问题，现提出一种基于RAA技术检测I群4型禽腺病毒的引物探针组合及试剂盒。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种基于RAA技术检测I群4型禽腺病毒的引物探针组合，引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，其中，探针的5′端第23位T碱基标记羧基荧光素，第24位碱基连接脱碱基位点四氢呋喃，第25位碱基标记BHQ1淬灭基团，3′端进行C3-spacer阻断修饰。

优选的，引物探针组合中的引物和探针是以I群4型禽腺病毒特异性Hexon基因为目的基因进行设计获得，其中，所述下游引物的核苷酸序列为对应I群4型禽腺病毒特异性Hexon基因的第1091位碱基前后的核苷酸序列的反向互补序列，且下游引物的核苷酸序列中与I群4型禽腺病毒特异性Hexon基因第1091位碱基对应的碱基设为简并碱基R。

优选的，所述引物探针组合应用在非疾病诊断目的的基于RAA技术检测I群4型禽腺病毒的检测中，且基于RAA技术检测I群4型禽腺病毒的检测方法包括如下步骤：

（1）配置阴性对照、阳性对照以及待检测样品的RAA反应体系，其中，RAA反应体系中所使用的引物探针组合为如上所述的引物探针组合；

（2）RAA反应体系扩增；

（3）根据RAA反应体系的扩增曲线判定待测样品中是否含有I群4型禽腺病毒，待测样品中是否含有I群4型禽腺病毒的判定方式为：