[发明专利]甬甜5号甜瓜种子纯度的快速鉴定方法

权利要求书

1.甬甜5号甜瓜种子纯度的快速鉴定方法，其特征在于，所述鉴定方法包括用SSR1、SSR2和SSR3三对特异性引物对甬甜5号甜瓜单株的幼苗DNA进行PCR扩增；

所述SSR1、SSR2和SSR3特异性引物的序列信息分别如下：

SSR1：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；

SSR2：SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；

SSR3：SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；

包括如下步骤：

（1）取样

播种甬甜5号种子，待植株子叶平展，第一片新叶展开时，采集新叶1g，在-80℃下保存；

（2）DNA提取

采用CTAB法提取新鲜叶片总基因组DNA；

（3）PCR扩增

SSR1、SSR2和SSR3特异性引物分别独立混样，用于PCR扩增；

每对SSR特异性引物的混样体系为15µl，包括1.5µl 浓度为2.5mM的dNTP，1.5ul 10×buffer，1.8ul 浓度为25mM的MgCl₂，2ul 浓度为5mM的引物，其中每对SSR特异性引物的两条序列分别添加1.0ul，5ul浓度为10ng/ul的DNA，1U的Taq 0.05ul，3.145ul超纯水；

PCR扩增程序为：预变性94℃ 1min；变性93℃ 1min，退火50℃ 1min，延伸72℃ 2min，进行40个循环；延伸72℃ 1min；

（4）PCR产物检测

使用2.5%高分辨率标准凝胶琼脂糖，添加20 µl溴化乙锭显色，在PCR产物中加入2µlLoading Dye，电泳2-3小时，电压200v，电泳结束后，利用凝胶成像系统观察结果；

（5）数据收集与分析；

（6）计算种子纯度。

2.根据权利要求1所述的甬甜5号甜瓜种子纯度的快速鉴定方法，其特征在于，所述鉴定方法还包括用所述SSR1、SSR2或SSR3特异性引物对鉴定的不纯合亲本进行扩增、提高亲本纯度的步骤。

3.根据权利要求2所述的甬甜5号甜瓜种子纯度的快速鉴定方法，其特征在于，当杂株表现为母本P1的多态性位点，父本P2对应位点不纯合时，用SSR1、SSR2或SSR3引物对不纯合父本P2进行扩增，剔除与P2多态性位点不同的单株。

4.根据权利要求1所述的甬甜5号甜瓜种子纯度的快速鉴定方法，其特征在于，每个单株的扩增产物经琼脂糖电泳分离、溴化乙锭染色后，检测多态性；通过观察扩增产物在标记多态性位点的差异特点判断该单株是否为杂种。

5.根据权利要求1所述的甬甜5号甜瓜种子纯度的快速鉴定方法，其特征在于，所述鉴定方法还包括如下步骤：

（7）亲本纯度提高

将检出的甬甜5号甜瓜杂株的扩增带型与亲本带型比对，当杂株表现为母本P1的多态性位点，父本P2对应位点不纯合时，用SSR1、SSR2或SSR3引物对不纯合父本P2进行扩增，剔除与P2多态性位点不同的单株，提高亲本纯度。