[发明专利]一种因毒性蛋白基因泄露表达克隆方法

说明书

本发明公开一种因毒性蛋白基因泄露表达克隆方法，包括如下步骤：步骤S1、将CcdB蛋白C端加SsrA多肽序列；步骤S2、通过PCR扩增方法得到基因片段，再利用Gibson重组到目标载体PUC57构建全序列；步骤S3、将目的基因序列连接克隆进入表达载体后，转化大肠杆菌，培养12‑16h，观察长斑情况以及进行PCR菌落筛选阳性克隆，同时抽提质粒测序，验证序列；可以在酵母中克隆，酵母属于真核生物，可以克隆绝大多数毒性蛋白，通过先在酵母中将基因克隆出，再抽提出酵母质粒，提高质粒浓度转化大肠杆菌进行质粒扩增，进行下游实验。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体为一种因毒性蛋白基因泄露表达克隆方法。

背景技术

大肠杆菌内的质粒，是独立于染色体，能自我复制的较小的DNA分子。本质上质粒是大肠杆菌的负担。它利用大肠杆菌内部的机器(复制系统、核糖体、转运tRNA等)和原材料(A/T/C/G/U、氨基酸)来复制自己，生产大肠杆菌本身生存并不需要的RNA和蛋白。当质粒的复制占用了太多的资源或者质粒表达的RNA或蛋白影响了宿主本身的生存时，大肠杆菌会死亡。这就是毒性基因发挥作用的原理。常见的对大肠杆菌有致死性的蛋白有，核酸酶、细胞分裂和复制相关蛋白、离子通道蛋白、信号调控蛋白，激酶、毒素、转座酶、整合酶，富含同一种氨基酸的蛋白、核糖体相关蛋白等等。

所有的生物体体内都有ClpXp和ClpAp蛋白酶系统，蛋白的C端如果有SsrA序列，(包含11个氨基酸序列为AANDENYALAA)，就会被蛋白酶识别，蛋白被降解，尤其是蛋白泄露表达的时候，少量的泄露表达毒性蛋白会被细菌自身降解，而诱导过量表达后，蛋白酶来不及降解这么多的重组蛋白，所以没有影响终止密码子前和目的蛋白融合。有时也会碰到虽然在毒性蛋白C端加入SsrA 11个氨基酸多肽，但是可能由于细菌内质粒拷贝数过高，蛋白泄露表达较严重，以致来不及降解，造成宿主菌死亡，面对此状况，我们可将基因克隆至次发明设计的低拷贝数、降低泄露表达载体PCCI-YAC中。

发明内容

为了克服上述的技术问题，本发明提供一种因毒性蛋白基因泄露表达克隆方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种因毒性蛋白基因泄露表达克隆方法，包括如下步骤：

步骤S1、将CcdB蛋白C端加SsrA多肽序列，序列如下所示：

atgcagtttaaggtttacacctataaaagagagagccgttatcgtctgtttgtggatgtacagagtgatatcattgacacgcccgggcgacggatggtgatccccctggccagtgcacgtctgctgtcagataaagtctcccgtgaactttacccggtggtgcatatcggggatgaaagctggcgcatgatgaccaccgatatggccagtgtgccggtgtccgttatcggggaagaagtggctgatctcagccaccgcgaaaatgacatcaaaaacgccattaacctgatgttctggggaataGCTGCTAACGACGAAAACTACGCTCTGGCTGCTTAA；

步骤S2、通过PCR扩增方法得到基因片段，再利用Gibson重组到目标载体PUC57构建全序列；

步骤S3、将目的基因序列连接克隆进入表达载体后，转化大肠杆菌，培养12-16h，观察长斑情况以及进行PCR菌落筛选阳性克隆，同时抽提质粒测序，验证序列。

进一步地，所述PCR扩增方法的步骤如下：

步骤S11、称取如下原料：1xPCR缓冲液，1-2mM MgCl₂，200-400nM巯基化修饰的引物，0.05-0.2mM dNTP，1-2U聚合酶；