[发明专利]一种因毒性蛋白基因泄露表达克隆方法

权利要求书

1.一种因毒性蛋白基因泄露表达克隆方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤S1、将CcdB蛋白C端加SsrA多肽序列，序列如下所示：

atgcagtttaaggtttacacctataaaagagagagccgttatcgtctgtttgtggatgtacagagtgatatcattgacacgcccgggcgacggatggtgatccccctggccagtgcacgtctgctgtcagataaagtctcccgtgaactttacccggtggtgcatatcggggatgaaagctggcgcatgatgaccaccgatatggccagtgtgccggtgtccgttatcggggaagaagtggctgatctcagccaccgcgaaaatgacatcaaaaacgccattaacctgatgttctggggaataGCTGCTAACGACGAAAACTACGCTCTGGCTGCTTAA；

步骤S2、通过PCR扩增方法得到基因片段，再利用Gibson重组到目标载体PUC57构建全序列；

步骤S3、将目的基因序列连接克隆进入表达载体后，转化大肠杆菌，培养12-16h，观察长斑情况以及进行PCR菌落筛选阳性克隆，同时抽提质粒测序，验证序列。

2.根据权利要求1所述的一种因毒性蛋白基因泄露表达克隆方法，其特征在于，所述PCR扩增方法的步骤如下：

步骤S11、称取如下原料：1xPCR缓冲液，1-2mMMgCl₂，200-400nM巯基化修饰的引物，0.05-0.2mMdNTP，1-2U聚合酶；

步骤S12、将DNA模板、巯基化修饰的引物、聚合酶、dNTP、PCR缓冲液和MgCl₂混合构成PCR体系，之后经过预变性，变性、退火和延伸三个步骤的循环，延伸，将目的片段进行扩增，制得基因片段。

3.根据权利要求2所述的一种因毒性蛋白基因泄露表达克隆方法，其特征在于，步骤S12中预变性的温度为90-95℃，预变性时间为2-10min，变性的温度为90-95℃，变性时间为15-60s，退火温度为45-60℃，退火时间为15-50s，延伸温度为60-70℃，延伸时间为30-100s，依次循环30次，之后在65-75℃延伸5-10min。

4.根据权利要求1所述的一种因毒性蛋白基因泄露表达克隆方法，其特征在于，步骤S3中转化大肠杆菌，培养的具体步骤包括：

第一步、称取胰化蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，将胰化蛋白胨、酵母粉和氯化钠依次加入800mL双蒸水溶解，用玻璃棒搅拌均匀，搅拌均匀后加入浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH，直至pH＝7.4，之后定容至1L，调节pH为7.4，之后分装在锥形瓶，向锥形瓶中加入琼脂，琼脂的用量为培养基重量的2％，之后在120-125℃下高温高压灭菌30min，之后在经过紫外杀菌1h的无菌操作台上，将培养基倒入培养皿中，放置在无菌操作台上，直至琼脂凝固，涂平板；

第二步、用移液枪吸取100μL转化大肠杆菌液于平板上，用酒精灯灭菌后的涂抹棒划十字，涂布平板，涂布结束后将培养皿置于37℃的恒温培养箱中培养14-16h。