[发明专利]自体皮肤成纤维细胞的制备方法

说明书

本发明公开了自体皮肤成纤维细胞的制备方法，方法步骤如下：S1：切取一块人自体脸颊或耳后皮肤组织，将组织在无菌环境下完全浸泡于组织处理液中10‑20min，将浸泡后的组织去除脂肪组织及结缔组织，剩余组织置于无菌培养皿中剪碎；S2：将剪碎后的组织加入37℃预热的的混合酶消化液进行消化，消化结束后加入终止消化液以终止消化；S3：将所得组织液合并至离心管中，离心，去除上清，向细胞沉淀加入细胞培养液，得到P₀成纤维细胞；S4：将P₀代细胞接种至培养瓶中，培养结束后收集细胞，得到P1代成纤维细胞，取样并计数细胞的数量和活率。本发明采用多种酶的混合消化液，可直接进行消化，操作过程简单，耗时短。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及自体皮肤成纤维细胞的制备方法。

背景技术

皮肤是包被在肌肉外面的组织，覆盖全身，是人体的最大的器官，可分为表皮、真皮和皮下组织三层，并包含脂腺、汗腺、毛发、指(趾)甲等附属器官。皮肤成纤维细胞(fibroblast，Fbs)是构成皮肤真皮的主要结构成分，可合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤维、透明质酸等细胞外基质，对于保持皮肤强度和弹性、修复损伤及美容美体具有重要作用。其正常的增值分化是维持皮肤正常的结构和生理功能。

人随着年龄的增长，皮肤成纤维细胞数量越来越少，活性越来越低，相应的其产生的胶原蛋白、弹性纤维、透明质酸这些物质就会减少，不足以支撑皮肤结构，导致真皮层变薄，皮肤开始松弛，失去弹性，出现皱纹。补充成纤维细胞能够从根源上解决面部皮肤衰老及损伤问题，让皮肤从初代细胞开始重生，因此，关于皮肤成纤维细胞的研究越来越受到人们的关注。

现有的提取皮肤成纤维细胞尚有诸多缺点，例如消化时间长，操作步骤繁琐，进而显示出这些方法不够简便高效。例如CN1569258(中国专利申请号03150373.X，公开日2005年01月26日)公开的题为“组织工程自体复合皮肤及其制备方法”的发明；CN110438067A(中国专利申请号201910777323.4，公开日2019年11月12日)公开的题为“人皮肤成纤维细胞及其制备方法”的发明；CN106176561A(中国专利申请号201610570608.7，公开日2016年12月07日)公开的题为“一种自体皮肤成纤维细胞用于美容抗衰的制备方法”的发明；CN109294981A(中国专利申请号201811304237.3，公开日2019年02月01日)公开的题为“一种人皮肤成纤维细胞提取方法及其培养基”的发明。以上专利存在消化时间长或需要消化两次及以上，或是消化后需要过滤，操作步骤繁琐，极易因人为的操作导致污染。

因此，需要研究一种与常规方法相比更高简化、更高效及更高经济效益，能足够工业应用之程度的方法，以获取纯度高、数量多、活性好、可传代次数高的皮肤成纤维细胞，这具有非常重要的意义和积极的应用前景。

发明内容

基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了自体皮肤成纤维细胞的制备方法，采用多种酶的混合消化液，可直接进行消化，操作过程简单，耗时短，且可得到纯度高、数量多、活性好、可传代次数高的皮肤成纤维细胞。

本发明提出的自体皮肤成纤维细胞的制备方法，方法步骤如下：

S1：切取一块人自体脸颊或耳后皮肤组织，将组织在无菌环境下完全浸泡于组织处理液中10-20min，将浸泡后的组织去除脂肪组织及结缔组织，剩余组织置于无菌培养皿中剪碎；

S2：将剪碎后的组织加入37℃预热的含Hank’s平衡盐溶液的混合酶消化液进行消化，消化结束后加入终止消化液以终止消化；

S3：将所得组织液合并至离心管中，离心，去除上清，向细胞沉淀加入细胞培养液，重悬至3-15ml作为原代细胞，后转移至培养皿培养，得到P₀成纤维细胞；

S4：将P₀代细胞接种至培养瓶中，培养结束后收集细胞，得到P1代成纤维细胞，取样并计数细胞的数量和活率。