[发明专利]一种基于锁核酸修饰的RMA法检测ALDH2基因多态性的试剂盒及检测方法

说明书

本申请属于生物检测技术领域，具体为一种基于锁核酸修饰的RMA法检测ALDH2基因多态性的试剂盒及检测方法，所述引物探针组包括检测ALDH2*2的引物、野生型探针和突变型探针；所述试剂盒，包括含有扩增反应试剂的检测管、缓冲液、醋酸镁、阳性对照、阴性对照；所述扩增反应试剂包括ALDH2*2上下游引物、ALDH2*2野生型和突变型探针、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸。

技术领域

本申请属于生物检测技术领域，具体为一种基于锁核酸修饰的RMA法检测ALDH2基因多态性的试剂盒及检测方法。

背景技术

人乙醛脱氢酶2(acetaldehyde dehydrogenase 2,ALDH2)是乙醛脱氢酶的1个亚类，可催化乙醛氧化为乙酸。ALDH2与亚洲人群最为密切的是ALDH2*2突变(rs671，1510GA)，突变率高达30％～50％。携带ALDH2*2突变基因的个体ALDH2酶活性下降，其中ALDH2*1/*2个体的酶活性仅为ALDH2*1/*1个体的10％，而ALDH2*2/*2个体的酶活性完全缺失。

ALDH2基因与酒精在人体内的分解代谢有关，还参与硝酸甘油的代谢。研究显示ALDH2基因型可影响饮酒者对乙醇的敏感性和耐受性，突变型基因ALDH2*2能导致ALDH2活力的严重缺失，并与过度饮酒导致的酒精依赖、酒精性中毒、酒精性肝病、消化道癌症等疾病之间存在深刻的联系。还有研究发现，ALDH2是催化硝酸甘油代谢成有扩血管作用的一氧化氮(NO)的关键酶，如果患者基因携带ALDH2*1/*2或ALDH2*2/*2，则硝酸甘油在体内的生物转化过程受阻，难以发挥药物作用，必须调整治疗方案。因此，根据ALDH2基因型制定患者的个体化治疗方案具有重要意义。

迄今为止，已报道的ALDH2基因多态性位点检测的方法有多种，包括PCR产物限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、荧光定量PCR、DNA直接测序、高分辨率溶解曲线(HRM)和基因芯片技术等，但这些方法步骤多、耗时长、要求高，难以用于临床常规检测。重组酶聚合酶扩增(Recombinase Mediated Amplification,RMA)技术是一种核酸等温扩增技术，主要依赖重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶三种酶。RMA反应可以在37～42℃进行，整个过程在30min内即可达到检测水平。锁核酸(LockedNucleic Acid，LNA)探针是选择性地将探针中的一些碱基修饰成LNA碱基，大大提高了探针与目的序列的亲和力，提高了探针的Tm值。LNA探针比传统的DNA探针有更高的灵敏度、稳定性和特异性，是一种更为可靠的检测基因分型的方法。

本发明采用锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法(LNA-RMA法)进行ALDH2基因多态性检测，更加快速、简便，能够提高单碱基突变检测的特异性和灵敏度。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本申请提供了一种基于锁核酸修饰的RMA法检测ALDH2基因多态性的试剂盒及检测方法，本申请是通过下述方案实现的：

一种基于锁核酸修饰的RMA法检测ALDH2基因多态性的引物探针组，包括检测ALDH2*2的引物、野生型探针和突变型探针，其中，

上游引物：5’-ATTACAGGGTCAACTGCTATGATGTGTTTGGA-3’；

下游引物：5’-GTCTTTACCCTCTCTTGTCACTTCTCAGGCTTA-3’；

野生型探针：

突变型探针：

优选的，所述探针的修饰基团有荧光基团和淬灭基团，所述淬灭基团修饰在THF3’端的T碱基上，荧光基团修饰在SNP位点的5’端T碱基上或SNP位点互补碱基的5’端T碱基上。