[发明专利]一种基于锁核酸修饰的RMA法检测ALDH2基因多态性的试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种基于锁核酸修饰的RMA法检测ALDH2基因多态性的引物探针组，其特征在于，包括检测ALDH2*2的引物、野生型探针和突变型探针，其中，

上游引物：5’-ATTACAGGGTCAACTGCTATGATGTGTTTGGA-3’；

下游引物：5’-GTCTTTACCCTCTCTTGTCACTTCTCAGGCTTA-3’；

野生型探针：

5’-AGTTGGGCGAGTACGGGCTGCAGGCATACAC(FAM-dT)GAAG(THF)GAAAAC(BHQ-dT)GTGAGT(C3spacer)-3’；

突变型探针：

5’-AGTTGGGCGAGTACGGGCTGCAGGCATACAC(ROX-dT)AAAG(THF)GAAAAC(BHQ-dT)GTGAGT(C3spacer)-3’。

2.如权利要求1所述的一种基于锁核酸修饰的RMA法检测ALDH2基因多态性的引物探针组，其特征在于，所述探针的修饰基团有荧光基团和淬灭基团，所述淬灭基团修饰在THF3’端的T碱基上，荧光基团修饰在SNP位点的5’端T碱基上或SNP位点互补碱基的5’端T碱基上。

3.如权利要求2所述的一种基于锁核酸修饰的RMA法检测ALDH2基因多态性的引物探针组，其特征在于，所述荧光基团用FAM或ROX修饰，所述淬灭基团用BHQ修饰。

4.如权利要求2所述的一种基于锁核酸修饰的RMA法检测ALDH2基因多态性的引物探针组，其特征在于，所述探针3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。

5.如权利要求2所述的一种基于锁核酸修饰的RMA法检测ALDH2基因多态性的引物探针组，其特征在于，所述探针覆盖SNP位点，在探针的SNP位点上做锁核酸(LNA)修饰。

6.如权利要求1所述的一种基于锁核酸修饰的RMA法检测ALDH2基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括含有扩增反应试剂的检测管、缓冲液、醋酸镁、阳性对照、阴性对照，所述扩增反应试剂包括ALDH2*2上下游引物、ALDH2*2野生型和突变型探针、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸。

7.如权利要求6所述的一种基于锁核酸修饰的RMA法检测ALDH2基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述引物对及检测探针组在扩增体系中的终浓度分别为10μM；所述聚环氧乙烷的终浓度为10％w/v；所述海藻糖的终浓度为2mM；所述甘露醇的终浓度为2.5mM；所述ATP的终浓度为10mM；所述dNTPs的终浓度为2mM；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/mL；所述磷酸肌酸的终浓度为25mM；所述大肠杆菌RecA蛋白的终浓度为100ng/μL；所述UvsY蛋白的终浓度为40ng/μL；所述单链结合蛋白GP32的终浓度为800ng/μL；所述Bst聚合酶的终浓度为60ng/μL；所述核酸外切酶III的终浓度为80ng/μL。

8.如权利要求6所述的一种基于锁核酸修饰的RMA法检测ALDH2基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为ALDH2*2野生型质粒和突变型质粒；所述阴性对照为无菌双蒸水。

9.如权利要求6所述的一种基于锁核酸修饰的RMA法检测ALDH2基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒可用于检测的样品为人全血、外周血样本。

10.如权利要求6所述的一种基于锁核酸修饰的RMA法检测ALDH2基因多态性的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待测样本DNA作为模板；(2)设计用于ALDH2*2基因多态性检测的引物对及探针；(3)以提取的待测样本DNA作为模板，加入上述试剂盒中的反应试剂进行RMA扩增反应；扩增反应条件为在实时恒温荧光检测器中39℃下扩增20分钟；(4)检测结果判定：对于野生纯合型样本，只有野生型探针产生荧光信号，而突变型探针没有产生荧光信号，说明突变型探针对野生型模板不会产生非特异性扩增；对于突变纯合型样本，只有突变型探针产生荧光信号，而野生型探针没有产生荧光信号，说明野生型探针对突变型模板不会产生非特异性扩增；对于突变杂合型样本，突变型探针和野生型探针都产生了荧光信号。