[发明专利]一种基于锁核酸修饰的RMA法检测CYP2C19基因多态性的试剂盒及检测方法

说明书

本申请属于生物检测技术领域，具体为一种基于锁核酸修饰的RMA法检测CYP2C19基因多态性的试剂盒及检测方法；所述引物和探针组分为两组，A组为检测CYP2C19*2和CYP2C19*3的引物对、野生型探针和突变型探针；B组为检测CYP2C19*17的引物对、野生型探针和突变型探针；所述试剂盒包括含扩增反应试剂A的检测管、含扩增反应试剂B的检测管、缓冲液、醋酸镁、阳性对照、阴性对照。

技术领域

本申请属于生物检测技术领域，具体为一种基于锁核酸修饰的RMA法检测CYP2C19基因多态性的试剂盒及检测方法。

背景技术

CYP2C19酶是人体重要的药物代谢酶，主要存在于肝微粒体中，目前已证实的由CYP2C19酶参与代谢并明显影响其临床应用的药物多达几十种，包括氯吡格雷、奥美拉唑、西酞普兰、苯妥英钠等。CYP2C19酶的编码基因为CYP2C19基因，位于人类10号染色体上。CYP2C19基因含有42个等位基因，CYP2C19基因的遗传变异导致CYP2C19酶活性的个体差异，使人群出现4种不同的代谢表型：快代谢型(RM，*1/*1)、中间代谢型(IM，*1/*2，*1/*3，*17/*2，*17/*3)、慢代谢型(PM，*2/*2，*2/*3，*3/*3)、超快代谢型(UM，*17/*17)。其中，CYP2C19*1为野生型等位基因，其编码的酶具有正常活性；CYP2C19*2(rs4244285，c.681GA)和CYP2C19*3(rs4986893，c.636GA)编码的CYP2C19酶活性降低，是中国人群中存在的2种主要的等位基因，在中国人群的发生频率分别约为30％和8.9％；CYP2C19*17(rs12248560，c.-806CT)编码的CYP2C19酶活性增强，在中国人群的发生频率约为0.7％。通过CYP2C19基因多态性检测，可将服药人群分为上述4类表型的代谢患者，从而用于相关药物的用药指导。

目前，针对CYP2C19基因多态性的检测方法很多，如荧光定量PCR法、限制性片段长度多态性分析法、直接测序、基因芯片等。但是这些方法基本上都操作复杂、检测周期长，且需要复杂的仪器设备、成本也较高。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase Mediated Amplification,RMA)技术是一种核酸等温扩增技术，主要依赖重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶三种酶。RMA反应可以在37～42℃进行，整个过程在30min内即可达到检测水平。锁核酸(LockedNucleic Acid，LNA)是一种特殊的双环状寡核苷酸衍生物，其结构中核糖的2'-O位和4'-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖C3'-内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性，提高了扩增反应中DNA分子的稳定性和亲和力。研究发现，在错配位点修饰1-3个锁核酸可明显提高单碱基错配的识别能力。LNA修饰的探针比传统的DNA探针有更高的灵敏度、稳定性、扩增效率和较低的探针浓度，是一种更为可靠的检测基因分型的方法。

本发明采用锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法(LNA-RMA法)进行CYP2C19基因多态性检测，更加快速、简便，能够提高单碱基突变检测的特异性和灵敏度。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本申请提供了一种基于锁核酸修饰的RMA法检测CYP2C19基因多态性的试剂盒及检测方法，本申请是通过下述方案实现的：

一种基于锁核酸修饰的RMA法检测CYP2C19基因多态性的引物探针组，所述引物和探针组分为两组，A组为检测CYP2C19*2和CYP2C19*3的引物对、野生型探针和突变型探针；B组为检测CYP2C19*17的引物对、野生型探针和突变型探针；其中，A组的CYP2C19*2引物和探针序列为：

正向引物：5’-AGCATTACTCCTTGACCTGTTAAACATCCGTAG-3’；

反向引物：5’-CAACCAGAGCTTGGCATATTGTATCTATACCT-3’；