[发明专利]柔嫩艾美耳球虫子孢子的分离纯化方法和接种方法

说明书

本发明提供一种柔嫩艾美耳球虫子孢子的分离纯化方法和接种方法，涉及生物技术领域。本发明的分离纯化方法包括：取感染鸡粪便，加水，过滤；离心，沉淀加入饱和食盐水，离心，上清液加水得卵囊稀释液；离心，沉淀加入氯胺T溶液，得孢子化卵囊悬液；离心，沉淀加入饱和食盐水重悬，离心收集卵囊沉淀；加入次氯酸钠溶液重悬，收集卵囊；震荡破碎，待孢子囊全部逸出停止震荡，离心得到孢子囊，加入胰酶消化液进行消化，过滤离心收集沉淀，得柔嫩艾美耳球虫子孢子。本发明的接种方法是将上述孢子囊或子孢子精准注射于小鸡肌胃和小肠中段，实现成功感染。本发明的纯化方法得到的孢子囊和子孢子的纯化程度高，实验操作简便，注射接种后感染成功率达100％。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种柔嫩艾美耳球虫子孢子的分离纯化方法和接种方法。

背景技术

球虫病被认为是家禽的重要传染病之一，每年给全世界养禽业造成超过20亿英镑的经济损失。艾美耳球虫是引起家禽球虫病的主要病原，可造成腹泻、体重减轻、产蛋量减少等症状，有时甚至死亡。此外，艾美耳球虫的感染可促进其他病原体(如产气荚膜梭菌)的机会性感染。并且，其卵囊对环境的耐受性很强，这使得控制措施变得相当困难。常规的疾病控制策略主要依赖于预防性用药，但是引起鸡球虫病的艾美耳球虫已对大多数抗球虫药产生了耐药性。因此，近年来国内外学者对鸡球虫虫种的鉴定、基因编辑、遗传稳定性和疫苗开发等方面进行了大量的研究工作。

鸡球虫孢子化卵囊包含4个孢子囊，孢子囊间的遗传基因存在不一致的现象，但每个孢子囊含2个基因组一致的子孢子。用于分子遗传学研究的群体必须基因组完全一致，而传统的单卵囊分离技术得到的产物存在基因组不纯的可能性，因此，单孢子囊和单子孢子接种获取克隆化群体的方式显得十分重要。已有研究报道，从既有早熟又有抗药性的卵囊群体中分离出单孢子囊，经分子遗传学鉴定得出口服接种的后代只来源于2种母系卵囊，说明单孢子囊接种的群体在遗传基因上是一致的，即真正意义上的克隆化群体。

目前，现有技术已经能够实现卵囊、孢子囊和子孢子的分离纯化，例如采用DE-52阴离子交换色谱纯化球虫子孢子。但是，在这种方法需要耗费的时间较长，涉及的器材较多，为获取克隆化卵囊群体带来较高的不稳定性。现有技术中也有利用显微镜分离单孢子囊，并建立柔嫩艾美耳球虫克隆的报道，但是成功率仅为17.8％。现有技术中还有报道，利用显微镜操作吸取单子孢子，并注射于解剖后暴露的鸡盲肠内，实现单子孢子的分离与接种，但是其成功率也仅达22％，而且操作难度系数大，精密设备需求度高，给研究带来诸多不便。

发明内容

基于此，有必要针对上述问题，提供一种柔嫩艾美耳球虫子孢子的分离纯化方法，得到的孢子囊和子孢子的纯化程度高，接种后感染成功率大大提升。

一种柔嫩艾美耳球虫子孢子的分离纯化方法，包括以下步骤：

S1、取感染柔嫩艾美耳球虫的鸡的粪便，加水稀释，过筛网，保留滤液；

S2、将滤液离心，收集沉淀，加入饱和食盐水重悬，离心，收集上清液，加水稀释，得到卵囊稀释液；

S3、将卵囊稀释液离心，收集沉淀，加入氯胺T溶液，待卵囊孢子化后，得到孢子化卵囊悬液；

S4、将孢子化卵囊悬液离心，收集沉淀，加入饱和食盐水重悬，离心，收集卵囊；

S5、向卵囊沉淀中加入次氯酸钠溶液重悬，离心，收集上层的卵囊；

S6、取卵囊，配制成悬液，进行震荡破碎，待全部孢子囊逸出，停止震荡，离心，收集沉淀，得到孢子囊；

S7、取孢子囊，配制成悬液，离心收集沉淀，加入胰酶消化液，消化至全部的子孢子释放，停止消化，离心收集沉淀，配制成悬液，过滤，所得沉淀即为柔嫩艾美耳球虫子孢子。