[发明专利]柔嫩艾美耳球虫子孢子的分离纯化方法和接种方法

权利要求书

1.一种柔嫩艾美耳球虫子孢子的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、取感染柔嫩艾美耳球虫的鸡的粪便，加水稀释，过筛网，保留滤液；

S2、将滤液离心，收集沉淀，加入饱和食盐水重悬，离心，收集上清液，加水稀释，得到卵囊稀释液；

S3、将卵囊稀释液离心，收集沉淀，加入氯胺T溶液，待卵囊孢子化后，得到孢子化卵囊悬液；

S4、将孢子化卵囊悬液离心，收集沉淀，加入饱和食盐水重悬，离心，收集卵囊；

S5、向卵囊沉淀中加入次氯酸钠溶液重悬，离心，收集上层的卵囊；

S6、取卵囊，配制成悬液，进行震荡破碎，待孢子囊逸出，停止震荡，离心，收集沉淀，得到孢子囊；

S7、取孢子囊，配制成悬液，离心收集沉淀，加入胰酶消化液，消化至全部的子孢子释放，停止消化，离心收集沉淀，配制成悬液，过滤，离心，所得沉淀即为柔嫩艾美耳球虫子孢子。

2.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤S1具体为：将柔嫩艾美耳球虫接种于1-2周龄的麻鸡，感染后5-6天进行球虫检测，收取6-10天的含有柔嫩艾美耳球虫卵囊的粪便；加2-3倍体积的水稀释粪便，依次过80目、100目、300目筛网，保留滤液。

3.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤S2具体为：将滤液在1400-1600rpm下离心3-4min，收集沉淀，加入1-3倍体积的食盐水，2700-2900rpm下离心3-4min，收集上清液，加入4-6倍体积水稀释，得到卵囊稀释液。

4.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤S3具体为：将卵囊稀释液在3200-3400rpm下离心1-3min，收集沉淀，加水洗涤，离心，保留沉淀，加入浓度为1.0w/v％的氯胺T溶液，卵囊浓度为10-20万个/mL，28℃下培养，待卵囊孢子化后，得到孢子化卵囊悬液。

5.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤S4具体为：将孢子化卵囊悬液在3500-3700rpm下离心4-6min，收集沉淀，加水洗涤，3500-3700rpm下离心4-6min，保留沉淀，加入饱和食盐水重悬，收集上层卵囊，加入4-6倍体积水洗涤，3500-3700rpm下离心4-6min，收集卵囊沉淀。

6.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤S5具体为：向卵囊沉淀中加入4-6倍体积的浓度为30w/v％次氯酸钠溶液重悬，0℃下静置5-7min，3500-3700rpm下离心4-6min，收集上层卵囊，加水洗涤，离心后保留沉淀，得到卵囊。

7.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤S6具体为：取卵囊配制成悬液，加入1-2倍体积的玻璃珠进行震荡破碎8-10min，待全部的孢子囊逸出，停止震荡，3500-3700rpm下离心4-6min，收集沉淀，得到孢子囊。

8.根据权利要求1-7任一项所述的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤S7具体为：取孢子囊，配制成悬液，加入胰酶消化液，在40-42℃下140-160rpm震荡消化60-90min，消化至全部的子孢子释放，停止消化，3500-4500rpm下离心8-12min，取沉淀加入PBS混匀，利用机械真空泵经G3砂芯漏斗过滤，3500-4500rpm下离心8-12min，沉淀即为柔嫩艾美耳球虫子孢子。

9.根据权利要求8所述的分离纯化方法，其特征在于，所述胰酶消化液为含有0.5w/v％胰蛋白酶和5.0w/v％牛磺脱氧胆酸钠的PBS缓冲溶液。

10.一种柔嫩艾美耳球虫子孢子的接种方法，其特征在于，取权利要求1-9任一项所述的纯化方法得到的柔嫩艾美耳球虫孢子囊或子孢子，用PBS缓冲液重悬后，注射到鸡的肌胃和/或小肠。