[发明专利]SPL3和miR156基因在鉴定抗从枝病泡桐的应用

说明书

本发明公开了一种抗丛枝病泡桐的早期分子鉴定方法，其中，包含获取泡桐叶片RNA；PCR检测并分析miR156和SPL3的表达量；预判其抗病性。本发明首次对抗丛枝病泡桐进行早期鉴定，该发明有助于抗丛枝病泡桐的选育，在泡桐育种上有巨大价值。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地说是涉及一种抗丛枝病泡桐的早期鉴定方法。

背景技术

泡桐，又叫白花泡桐、大果泡桐，空桐木等，树皮灰色、灰褐色或灰黑色，幼时平滑，老时纵裂。假二杈分枝，单叶，对生，叶大，卵形，全缘或有浅裂，具长柄，柄上有绒毛；喜光，较耐阴，喜温暖气候，耐寒性不强。其生长速度快，耐瘠薄，材性优良，在防风固沙、保障粮食安全和木材供应等方面起着重要的作用。

泡桐丛枝病是泡桐生产中最严重的病害之一，感病的幼苗、幼树常于当年枯死，大树感病后会引起树势衰退，材积生长量大幅度下降甚至造成死亡。目前，，丛枝病的防治目前费时费力，培育抗丛枝病的泡桐品种才是预防的根本，因此，开展抗丛枝病泡桐的选育是有必要的。

因此，如何对抗丛枝病泡桐进行早期的分子鉴定是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明以SPL3和miR156基因在泡桐树中的表达量为指标对抗从枝病的泡桐进行鉴定，简单高效。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

SPL3和miR156基因在以Real-Time PCR方法鉴定抗从枝病泡桐中的应用。

miR156的靶基因为SPL，miR156和SPL特定存在于植物中，对于维持植物的生长发育、非生物胁迫和合成代谢具有关键作用，miR156对SPL3具有调控作用，而且miR156对SPL3的调控主要通过SPL3蛋白翻译后的抑制来实现的，所以在同一时期，植物体内miR156和SPL3基因的表达量呈相反趋势。MiR156通过切割SPL3转录本来影响枝条分支和植物构型。miR156的过表达促进了腋芽的萌生和生长，同时抑制了SAM的活性，导致了矮化植物的表型。SPL3通过影响独脚金内酯的信号传导进而调控植物的分枝。在选育过程中，miR156表达量较低同时SPL3表达量较高的候选植株，其出现丛枝症状的可能性较低。

一种鉴定抗从枝病泡桐的引物，以SPL3和miR156基因进行鉴定，且所述引物序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示；

miR156F-5P-qF：GACAGAAGATAGAGAGCACAA，如SEQ ID NO.1所示；

miR156F-5P-qR：GeneCopoeia公司的All-in-One^TMmiRNA qRT-PCR DetectionKit试剂盒配有下游通用引物Universal AdaptorPCR Primer；

pau-SPL3-qF:TTCTGTCATCTAACTCTTG，如SEQ ID NO.2所示；

pau-SPL3-qR:CCTCATCACTGGATTATAG，如SEQ ID NO.3所示。

一种抗丛枝病泡桐的早期分子鉴定方法，包括下述步骤：

(1)获取泡桐叶片：在同树龄泡桐样地，用高枝剪取待鉴定泡桐顶芽下部第一轮叶片；

(2)泡桐RNA抽提：采用研磨法提取泡桐叶片RNA，并用分光光度计评估RNA样品的纯度和浓度，最后纯化RNA样品，并将RNA保存在-80℃以备后用；

(3)合成cDNA：用Surescript^TMcDNA第一链合成试剂盒进行反转录反应，反应结束后，85℃灭活处理5min，-20℃保存反转录产物待用；