[发明专利]基于水稻稻瘟病抗性基因RGA4第二外显子插入突变的功能性PARMS标记与应用

说明书

本发明公开了基于水稻稻瘟病抗性基因RGA4第二外显子插入突变的功能性PARMS标记与应用，利用一代测序检测RGA4在高抗稻瘟病材料Y009和感病品种日本晴中差异，发现在该基因第2外显子2155和2156位点发生TC碱基插入，导致氨基酸序列变异。在设计的正向引物中引入这两个碱基的差异，并在此基础上增加两条不同荧光标记通用引物，开发基于PARMS技术的水稻稻瘟病抗性基因RGA4的荧光功能分子标记，便于RGA4基因在水稻抗性分子育种上应用。

【技术领域】

本发明属于基因工程技术领域，涉及基于水稻稻瘟病抗性基因RGA4第二外显子插入突变的功能性PARMS标记与应用。

【背景技术】

稻瘟病是由稻瘟菌引起的一种水稻毁灭性真菌病害，严重影响世界水稻种植区的产量与品质，从而威胁全球粮食安全，而水稻是人类赖以生存的主要粮食作物之一，它是超过一半世界人口的主粮。稻瘟病是世界水稻生产上最具毁灭性的真菌病害之一，至今已有80余个国家报道有稻瘟病的发生，其中以亚洲和非洲发病最为严重。据估计，每年因稻瘟病损失的水稻足以养活6000万人。

化学防治作为一种主要、传统的病虫害防治手段，长期使用既污染环境，也增加经济成本。培育抗病水稻品种是最有效、最经济的策略。分子育种实践表明，分析水稻重要农艺性状基因的基因结构变异，开发目标基因功能标记，可实现基因的直接选择和有效聚合，大幅度提高育种效率，缩短育种时间。现已有相关的研究，例如中国专利申请CN201911323142一种人工改造的水稻抗病基因RGA5-HMA2，以RGA5基因为基础，将RGA5所编码蛋白质碳末端的重金属(HMA)结构域进行点突变，获得了RGA5基因突变体RGA5-HMA2，表明RGA5-HMA2所编码的蛋白质能够特异性识别稻瘟病菌的效应蛋白AvrPib，以解除其对RGA4基因的抑制作用，激活水稻体内的免疫反应，改变了其识别从而使含有该抗病基因的水稻获得了对含有AvrPib效应蛋白的稻瘟菌抗性，对于水稻抗稻瘟病遗传改良及抗病品种选育具有重要意义。又例如中国专利CN202010869538-水稻稻瘟病抗性基因Pikg、编码蛋白及其应用，水稻稻瘟病抗性基因Pikg包括Pikg-1和Pikg-2，其编码区核苷酸序列和编码蛋白的氨基酸序列分别如序列表所示，可用于提高水稻植株对稻瘟病菌的抗性。

目前常用的分子标记RFLP，RAPD，CAPS，AFLP，SSR，ISSR，STS，SRAP和IRAP可用于目标基因的连锁分析、检测，但是这些标记检测耗时长、操作繁琐、效率低、自动化程度低并且使用有毒物质等缺点，不适用于大规模的基因型分析。过去也开发了大量与抗稻瘟病基因连锁的分子标记，如RFLP标记、SSLP标记、RAPD标记，用分子标记定位一个未知的抗稻瘟病基因、STS标记和SNP标记等，但这些标记仅是紧密连锁的标记，而且需要依赖构建相应F2群体才能使用，从而影响了标记的利用效率。

单核苷酸多态性SNP，是指在基因组水平上引起的单个碱基的变异，其在群体中的发生频率不小于1％。SNP可以发生在基因组的任何位置，作为新一代分子标记，具有数量多、分布均匀、多态性丰富、精度高等优点。PARMS技术，即五引物扩增受阻突变体系，是最新开发出的基于荧光检测的SNP基因分型方法，该技术利用五条引物(一对通用荧光引物、一对等位基因特异引物和一条反向共用引物)对SNP或短Indel位点进行等位基因特异性扩增，通过荧光扫描进行基因分型，具有操作简便、耗时短、成本低的优势。基于PARMS技术开发的荧光分子标记，检测样品只通过一次PCR扩增，不需要电泳检测，而直接在原板上用荧光扫描仪获取扩增数据，经过软件分析，快速获得相应基因型结果。

因此，为了提高选择的效率，有必要发展新型的分子标记。

【发明内容】