[发明专利]基于水稻稻瘟病抗性基因RGA4第二外显子插入突变的功能性PARMS标记与应用

权利要求书

1.基于水稻稻瘟病抗性基因RGA4第二外显子插入突变的功能性PARMS标记与应用，其特征在于：

1)水稻材料稻瘟病抗性鉴定：以日本晴为对照，在苗期人工接种鉴定多份水稻材料的稻瘟病抗性，筛选出抗稻瘟病生理小种ZC3和ZC13的材料Y009；

2)RGA4基因结构分析：提取Y009和日本晴新鲜叶片的DNA，分段扩增，纯化后送生物公司测序，利用软件Vector NTI 11分析RGA4基因在两个水稻材料中的差异，发现在该基因第2外显子2155和2156位点发生TC碱基插入突变；

3)RGA4基因功能标记的设计与合成：根据RGA4第2外显子TC插入突变，设计了1个PARMS分子标记PARMS-RGA4，该标记由3条RGA4基因的特异引物构成，在设计的正向引物中引入两个碱基的差异：

正向引物RGA4-Ra：TATGGGGCTTTCAGATGTCTCTGAAGGTGACCAAGTTCATGCT；

正向引物RGA4-Rg：TGGGGCTTTCAGATGTCTCCGAAGGTCGGAGTCAACGGATT；

反向引物RGA4-F：CTAGATCCTTGTCATGTACAAGAAGG；

另外包含两条通用引物，分别与两条正向引物中有下划线的部分一致，两条通用引物尾部加有不同的荧光标记：

#1：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT；

#2：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT；

4)PARMS-RGA4的使用：标记的3条根据RGA4基因序列设计的引物及两条通用荧光引物同时加入到PCR反应体系进行扩增，RGA4等位基因序列根据SNP差异与正向引物RGA4-Fg匹配而扩增获得FAM荧光信号值，与正向引物RGA4-Fa匹配而扩增获得HEX荧光信号值，如果水稻样品在该位点为杂合状态，则两种正向引物同时扩增；

5)RGA4基因的PCR扩增与基因分型：鉴定聚合多个抗性基因的多份水稻材料的稻瘟病抗性后，利用PARMS-RGA4对稻瘟病基因RGA4分型，将所设计的3条引物RGA4-Fg、RGA4-Fa和RGA4-R及#1、#2两条通用引物同时加入到PCR反应体系中，上述PCR反应体系为10μL：5μL 2×PARMS master mix，0.15μL10 mM RGA4-Fg标记引物，0.15μL10 mM RGA4-Fa标记引物，0.4μL10 mM RGA4-R通用反向引物，1μL模板DNA，3.3μL ddH₂O；

PCR产物在包含FAM、HEX和ROX三种荧光检测通道的酶标仪中进行快速检测，读取荧光强度信号值，然后将荧光信号值文件通过SNP decoder http://www.snpway.com/snpdecoder01/软件分析，获得每个样品扩增的FAM和HEX荧光信号强度，并对每个信号点用图形方式输出，最后根据荧光信号强度，自动进行基因分型，获得基因型结果；

根据荧光信号值进行分析，荧光扫描获得FAM荧光信号，蓝色的是感稻瘟病RGA4等位基因TC类型材料，获得HEX荧光信号，绿色的是抗稻瘟病RGA4、--类型材料，灰色为阴性对照；

6)PARMS-RGA4有效性评估：对聚合多个抗性基因的水稻材料进行分析，确定表型、基因型。

2.根据权利要求1所述的基于水稻稻瘟病抗性基因RGA4第二外显子插入突变的功能性PARMS标记与应用，其特征在于：步骤1)所述的多份，是210-250份。

3.根据权利要求1所述的基于水稻稻瘟病抗性基因RGA4第二外显子插入突变的功能性PARMS标记与应用，其特征在于：步骤2)所述的提取Y009和日本晴新鲜叶片的DNA，是采用CTAB法提取Y009和日本晴新鲜叶片的DNA。

4.根据权利要求1所述的基于水稻稻瘟病抗性基因RGA4第二外显子插入突变的功能性PARMS标记与应用，其特征在于：步骤5)所述的鉴定聚合多个抗性基因的多份水稻材料，是鉴定聚合多个抗性基因的70-80份水稻材料。