[发明专利]一种具有反转录酶活性的DNA聚合酶I大片段及其编码基因、制备方法和应用

说明书

本发明提出了一种具有反转录酶活性的DNA聚合酶I大片段及其编码基因、制备方法和应用，所述DNA聚合酶来源于光合藻类，属于I型DNA聚合酶，其具有很高的DNA聚合酶和外切酶活性，同时具有一定的反转录酶活性。本发明具有反转录酶活性的DNA聚合酶I大片段可以用于延伸DNA，制备DNA，同时可以用于以RNA为模板连，利用其反转录酶活性，合成互补的DNA链(cDNA)。将其克隆到pET28表达载体，通过重组表达载体在大肠杆菌中诱导表达，经固定化镍离子亲和纯化，制备DNA聚合酶。将其用于反转录反应，合成cDNA，用于RNA检测与cDNA编码基因的克隆。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种具有反转录酶活性的DNA聚合酶I大片段及其编码基因、制备方法和应用。

背景技术

细菌、古菌和真核生物等编码众多DNA聚合酶作为DNA复制的核心蛋白，完成基因组DNA的复制、加工和分配过程。DNA聚合酶的主要功能是催化DNA合成反应，以DNA单链作为模板，利用dNTP作为原料合成新的互补DNA；另外DNA聚合酶还会对新链进行校对(3’-5’外切酶活性)和修复(5’-3’外切酶活性)，以确保复制过程的保真度和准确性。部分DNA聚合酶还可以RNA为模板，合成互补的DNA链，因此又称为反转录酶。反转录酶在RNA分子的检测与基因克隆方面有着重要应用。

DNA聚合酶的种类繁多，各种DNA聚合酶在结构和功能上既有相似的地方，又有各自的特性。例如众多热稳定性DNA聚合酶用于PCR(聚合酶链式反应)技术，在生命科学研究及相关领域发挥重要作用。反转录酶用于将RNA模板合成互补DNA链。

DNA与RNA的检测在现在生命科学中具有广泛应用。例如，基于Taq酶的DNA扩增反应，在病毒、微生物等各种检测中具有各种应用。其中，RNA检测不同于DNA检测。绝大部分DNA聚合酶只能以DNA为模板进行DNA合成；而RNA的检测需要先把RNA先转化为DNA，才能够再利用Taq DNA聚合酶等来检测DNA。

反转录酶是一种特殊的DNA聚合酶，既能够利用RNA也能够利用DNA为模板，合成互补的DNA链。其中利用RNA为模板时的DNA聚合酶活性成为反转录酶。目前，常用的反转录酶为MMLV反转录酶，其具有很强的反转录酶活性，但热稳定较差。目前开发的一些热稳定性提高的反转录酶活性较低，需要开发热稳定性好、活性高的反转录酶。

发明内容

本发明的目的在于提出一种具有反转录酶活性的DNA聚合酶I大片段及其编码基因、制备方法和应用，所述具有反转录酶活性的DNA聚合酶I大片段同时具有DNA聚合酶活性与反转录酶活性，可应用于合成目的DNA、将RNA转录成DNA。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供一种具有反转录酶活性的DNA聚合酶I大片段，其氨基酸序列如序列表中序列1所示。

本发明进一步保护一种编码上述具有反转录酶活性的DNA聚合酶I大片段的基因，其核苷酸序列如序列表中序列2所示。

本发明进一步保护含上述基因的重组表达载体。

本发明进一步保护含上述重组表达载体的重组菌。

作为本发明的进一步改进，所述重组菌为大肠杆菌。

本发明进一步保护一种上述的具有反转录酶活性的DNA聚合酶I大片段的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.构建上述的重组表达载体；

S2.将重组表达载体转入宿主细胞，并对宿主细胞进行扩大培养、诱导表达；

S3.收集诱导培养后的菌体，进行破碎、加热、离心，得到上清液；

S4.对上清液进行纯化，得到所述具有反转录酶活性的DNA聚合酶I大片段。