[发明专利]一种基于DNA-多肽探针技术定量核酸的质谱方法和应用

说明书

本发明属于生物快速检测技术领域，具体涉及一种基于DNA‑多肽探针技术定量核酸的质谱方法，包括如下步骤：以待测核酸的核苷酸序列为基础，设计DNA探针；筛选出特征多肽，并与所述DNA探针构建DNA‑多肽探针；将DNA‑多肽探针与待测核酸杂交；将杂交后的DNA‑多肽探针进行蛋白酶酶解，将DNA‑多肽探针中的特征多肽水解为报告肽；构建报告肽的LC‑MS/MS检测方法；利用构建的LC‑MS/MS检测方法对报告肽的浓度进行检测；由报告肽的浓度换算为待测核酸的拷贝数，实现对待测核酸的定量检测。基于上述方法，将核酸的定量转换为多肽的定量，具有检测效率高、特异性强的优势；此外，通过该方法对肝癌标志物HULC进行检测，更有利于对肝癌进行风险评估。

技术领域

本发明属于生物快速检测技术领域，具体涉及一种基于DNA-多肽探针技术的lncRNA质谱定量的方法和应用。

背景技术

长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA。随着研究的逐步深入，lncRNA的功能逐渐被研究者发掘，其与肿瘤的发生发展密切相关。而HULC是在肝癌中发现最早的lncRNA，研究发现HULC在肝癌患者中显著升高，且可参与调控肝癌发生的分子机制，有望成为肝癌诊断的潜在生物学标志物。

目前定量检测lncRNA的方法主要有荧光染料法、Northern印迹分析、微阵分析(microarray)、紫外分光光度法和实时定量PCR(quantitative Real-Time PCR，qRT-PCR)等。荧光染料法试剂价格高、稳定性较差，Northern印迹和微阵分析分析时间长且动态范围窄，紫外分光光度法灵敏度低只能测定总核酸量，且易受到被检样品中其他杂质的干扰。qRT-PCR是目前核酸拷贝数定量的主要技术，该技术通过在PCR反应体系中加入荧光结合染料(SYBR green I)或荧光标记的探针(如Taq Man Probes)，利用实时积累的荧光信号监测整个扩增过程通过标准曲线知模板进行定量分析。qRT-PCR需要的样本较少，但qRT-PCR技术通常需要对目标RNA进行预扩增以及进一步的荧光团标记步骤，而样品间背景的不同将影响PCR的扩增效率和响应，荧光染料的淬灭会影响信号收集从而引入偏差。目前尚无一种可直接特异检测lncRNA的定量方法，因此，开发能够以灵敏和直接的方式提供lncRNAs定量结果的新策略势在必行。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于DNA-多肽探针技术定量核酸的质谱方法，对核酸的检测具有较高的检测效率和检测特异性；利用本发明构建的核酸质谱定量检测方法对肝癌标志物HULC在肝细胞中的拷贝数进行检测，用于肝癌风险评估，作为本发明的第二个目的。

基于上述目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种基于DNA-多肽探针技术定量核酸的质谱方法，包括如下步骤：

(1)以待测核酸的核苷酸序列为基础，设计DNA探针；筛选出特征多肽，并与DNA探针构建DNA-多肽探针；

(2)将由步骤(1)构建的DNA-多肽探针与待测核酸杂交；

(3)将杂交后的DNA-多肽探针进行蛋白酶酶解，将DNA-多肽探针中的特征多肽水解为报告肽；

(4)构建报告肽的LC-MS/MS检测方法；

(5)利用LC-MS/MS检测方法对报告肽的浓度进行检测；

(6)由报告肽的浓度换算为待测核酸的拷贝数，实现对待测核酸的定量检测。

本发明通过待测核酸与DNA-多肽探针的偶联，通过将核酸的定量转移为特征多肽的定量；由于DNA探针与待测核酸的碱基序列互补配对，使得对核酸的检测具有高度特异性；此外，通过HPLC-MS/MS对特征多肽的高效、精准的定量检测，实现对RNA的精准定量，解决了现有RNA定量方法存在的非特异性和精度低的问题。