[发明专利]一种基于DNA-多肽探针技术定量核酸的质谱方法和应用有效
| 申请号： | 202110222482.5 | 申请日： | 2021-02-26 |
| 公开（公告）号： | CN113005179B | 公开（公告）日： | 2021-11-16 |
| 发明（设计）人： | 黄宪章;张乔轩;蔡志梁;韩丽乔;严君;展敏;欧阳芬;王建兵;柯培锋;庄俊华 | 申请（专利权）人： | 广东省中医院(广州中医药大学第二附属医院;广州中医药大学第二临床医学院;广东省中医药科学院) |
| 主分类号： | C12Q1/682 | 分类号： | C12Q1/682;C12Q1/6886 |
| 代理公司： | 广州三环专利商标代理有限公司 44202 | 代理人： | 颜希文 |
| 地址： | 510120 广*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 基于 dna 多肽 探针 技术 定量 核酸 方法 应用 | ||
1.一种非诊断目的的基于DNA-多肽探针技术定量HULC的质谱方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）以待测核酸的核苷酸序列为基础，设计DNA探针；筛选出特征多肽，并与所述DNA探针构建DNA-多肽探针；所述DNA-多肽探针中DNA探针的核苷酸序列从5’端到3’端的序列为TTGATGATATTTTGCCATGCTT；
（2）将由步骤（1）构建的DNA-多肽探针与待测核酸杂交；
（3）将杂交后的DNA-多肽探针进行蛋白酶酶解，将DNA-多肽探针中的特征多肽水解为报告肽；
（4）构建报告肽的LC-MS/MS检测方法；
（5）利用LC-MS/MS检测方法对报告肽的浓度进行检测；
（6）由报告肽的浓度换算为待测核酸的拷贝数，实现对待测核酸的定量检测；
所述步骤（1）中DNA-多肽探针的具体构建过程如下：
A.将设计的DNA探针合成为5’端含有二硫键修饰的DNA探针；
B.将二硫键修饰的DNA探针中的二硫键进行还原；
C.将二硫键还原后的DNA探针与等量的马来酰亚胺修饰的特征多肽偶联反应，制得DNA-多肽探针；
所述DNA-多肽探针中的特征多肽的氨基酸序列为GDKAVLGVDPFR；所述报告肽的氨基酸序列为AVLGVDPFR；
所述步骤（6）由报告肽的浓度换算为待测核酸的拷贝数的具体换算关系为：待测核酸的拷贝数copies/L=3.78×1021×x mol/L，其中，x mol/L表示经LC-MS/MS检测得到的报告肽的摩尔浓度。
2.根据权利要求1所述基于DNA-多肽探针技术定量HULC的质谱方法，其特征在于，所述步骤（2）中DNA-多肽探针与待测核酸的杂交过程如下：
I.将生物素标记的待测核酸与链霉亲和素磁珠重悬孵育形成生物素化待测核酸；
II.将生物素化待测核酸与DNA-多肽探针按照摩尔比1:1混合，进行杂交孵育制得含有待测核酸的DNA-多肽探针。
3.根据权利要求2所述基于DNA-多肽探针技术定量HULC的质谱方法，其特征在于，所述LC-MS/MS检测报告肽的质谱参数如下：一级质谱m/z为487.3；二级质谱m/z为690.3。
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