[发明专利]一种具有热稳定性的γ-谷酰胺甲胺合成酶的突变体，其编码基因、氨基酸序列及其应用

说明书

本发明公开了一种具有热稳定性的γ‑谷酰胺甲胺合成酶的突变体、其编码基因、氨基酸及在生产茶氨酸中的应用，具体是通过基因工程方法获得了γ‑谷氨酰甲胺合成酶突变体；改突变体半衰期长，在提高了γ‑谷氨酰甲胺合成酶突变体的热稳定性同时，使酶的最适温度提高了10～15℃，并且该突变体不需要在缓冲盐溶液中就能发挥很好的催化效果，同时利用该突变体通过耦合多聚磷酸盐激酶的方法高效合成茶氨酸，该方法催化茶氨酸合成的同时可实现ATP再生，为酶法工业化生产茶氨酸提供有效途径。

技术领域

本发明涉及一种酶突变体，特别涉及一种具有热稳定性的γ-谷酰胺甲胺合成酶的突变体、其编码基因、氨基酸及在生产茶氨酸中的应用。

背景技术

L-茶氨酸(L-theanine)属于酰胺类化合物，是茶叶中含量最丰富的游离氨基酸，占总游离氨基酸的50％以上。茶氨酸为是茶叶香味和口感的主要成分，其含量对茶叶的风味和品质起到关键性的作用。茶氨酸的性质较稳定，将茶氨酸溶液煮沸5min，或将茶氨酸溶于pH3.0的溶液中并在25℃下储放12个月，茶氨酸含量不变。因此在通常的食品加工、杀菌过程中，茶氨酸的性质不会发生变化，且毒性试验中未发现其有毒性。

L-茶氨酸作为一种安全、集多种生理功能于一体的功能性活性因子，被广泛应用于食品、保健品和医药行业。日本于1964年将以茶氨酸列为食品添加剂，作为调味剂和强化剂使用，使用过程中不作限制用量的规定。美国食品和药物管理局于1985年确认茶氨酸是一般公认为安全的物质(GRAS)，在食品中使用没有特定用量限制。2014我国卫生部批准茶叶茶氨酸为新食品原料，规定L-茶氨酸摄入量不得超过0.4g/d，使用范围不包括婴幼儿食品。此外，国际食品法典委员会(CODEX)标准将L-茶氨酸批准为风味强化剂，不作限制用量的规定，韩国和中国台湾也批准L-茶氨酸为食品添加剂。

微生物酶法生产茶氨酸作为近年来较为经济和温和的方法，必将在未来产业应用中大有前景。γ-谷氨酰甲胺合成酶(γ-glutamylmethylamide synthetase，GMAS)是一种能够催化L-谷氨酸和甲胺合成N-甲基-L-谷氨酰胺的催化用酶，该反应需要消耗ATP。专利CN201410316269利用大肠杆菌产γ-谷氨酰甲胺合成酶高效生产L-茶氨酸，在大肠杆菌中表达γ-谷酰胺甲胺合成酶基因，可以谷氨酸和乙胺为底物生产茶氨酸，50mM限制底物，8h谷氨酸转化率达到69.8％；专利CN201510755912在大肠杆菌中表达γ-谷酰胺甲胺合成酶基因，可以谷氨酸和乙胺为底物生产茶氨酸，150mM限制底物，转化率低于50％，生产周期长于30h，效率低，不适合工业生产。在CN201510973289中以γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶为催化剂，在咪唑溶液中以L-谷氨酸钠和乙胺盐酸盐为底物合成L-茶氨酸。100mL体系中限制底物最高200mM，转化率87％，反应体系较小，且咪唑为反应环境，对环境和成本均不友好。专利CN201880024038公开了一种使用以乙醛和丙氨酸作为底物生成乙胺的活性、以及γ-谷氨酰甲胺合成酶活性或谷氨酰胺酶活性增强的微生物，能够在不从外部添加乙胺且不会蓄积、残留乙胺作为副产物的情况下高效地制造茶氨酸，但乙醛并不安全，此举并无太多益处。γ-谷氨酰甲胺合成酶虽然是更为优良的催化剂，但据已有文献报道或专利发明文件来看，其生产茶氨酸的效率并不高。阻碍微生物酶法生产茶氨酸效率的一个原因是γ-谷氨酰甲胺合成酶容易失活。从相关文献的报道来看，茶氨酸的生产速率随着反应时间的延长而降低，符合酶的失活曲线，此为酶本身的性质决定。因此，如何提高γ-谷氨酰甲胺合成酶的热稳定性以及提高其生产茶氨酸的效率，为酶法工业化生产茶氨酸提供有效途径是当前亟需解决的技术问题。

发明内容

针对现有技术中的不足之处，本发明通过基因工程方法获得了一种具有热稳定性的γ-谷氨酰甲胺合成酶突变体；并且，不仅在提高了γ-谷氨酰甲胺合成酶突变体的热稳定性同时，使酶的最适温度提高了10～15℃，并且该突变体不需要在缓冲盐溶液中就能发挥很好的催化效果，同时利用该突变体通过耦合多聚磷酸盐激酶的方法高效合成茶氨酸，该方法催化茶氨酸合成的同时可实现ATP再生，为酶法工业化生产茶氨酸提供有效途径。