[发明专利]一种重组溶瘤病毒及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种重组溶瘤病毒，其特征在于，所述重组溶瘤病毒的基因组中包括E1A基因编码序列以及表达E1A基因的元件，

所述表达E1A基因的元件包含：E1A基因的启动子，为Ki67基因的启动子；以及TGFbeta2的5’UTR序列，位于E1A基因编码序列的上游且位于Ki67基因的启动子的下游；所述Ki67基因的启动子的碱基序列如序列表中SEQ ID NO.5所示；所述TGF beta2的5’UTR的碱基序列如序列表中SEQ ID NO.11所示；所述Ki67基因的启动子与所述TGF beta2的5’UTR连接形成融合序列。

2.根据权利要求1所述的重组溶瘤病毒，其特征在于，所述重组溶瘤病毒基因组中还包括：IL-15基因编码序列以及表达IL-15基因的元件。

3.根据权利要求2所述的重组溶瘤病毒，其特征在于，所述表达IL-15基因的元件包含：IL-15基因的启动子，为CMV启动子；以及SV40的polyA序列。

4.根据权利要求2所述的重组溶瘤病毒，其特征在于，所述IL-15基因为人IL-15基因。

5.根据权利要求2所述的重组溶瘤病毒，所述IL-15基因的碱基序列如SEQ ID NO.16所示。

6.根据权利要求1-5任一项所述的重组溶瘤病毒，其特征在于，所述重组溶瘤病毒是对野生型腺病毒的改造，所述野生型腺病毒为Ad5型溶瘤腺病毒。

7.权利要求2-6任一项所述的重组溶瘤病毒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

步骤1：将ki67基因的启动子和TGF beta2的5’UTR的融合序列克隆到pTE-ME1载体上，由此通过酶切获得包含ki67、UTR和E1A区域的序列片段；

步骤2：将IL-15序列插入pShuttle-CMV的多克隆位点，由此得到pShuttle-IL-15；

步骤3：将所述包含ki67、UTR和E1A区域的序列片段克隆到pShuttle-IL-15上，由此得到pshuttle-ki67-UTR-IL-15；

步骤4：将pshuttle-ki67-UTR-IL-15与pAdEasy-1于大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，由此得到pAd-ki67-UTR-IL-15腺病毒载体；

步骤5：pAd-ki67-UTR-IL-15腺病毒载体在293细胞中进行重组病毒颗粒的组装，得到Ad-ki67-UTR/IL-15腺病毒。

8.根据权利要求7所述的重组溶瘤病毒的制备方法，其特征在于，

所述融合序列中，ki67基因的启动子和TGF beta2的5’UTR通过BglII酶形成的粘末端连接。

9.根据权利要求7所述的重组溶瘤病毒的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述融合序列插到pTE-ME1的BamHI与XhoI酶切位点间，所述酶切采用MfeⅠ酶完成；步骤2中，将IL-15序列插入pShuttle-CMV的Bg1Ⅱ和Sa1Ⅰ酶切位点间；步骤3中，所述包含ki67、UTR和E1A区域的序列片段克隆到pShuttle-IL-15的两个MfeⅠ酶切位点间。

10.权利要求1-6任一项所述的重组溶瘤病毒或权利要求7-9任一项所述的制备方法在制备治疗、抑制或减缓胶质瘤药物方面的应用。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述胶质瘤为胶质母细胞瘤。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述胶质母细胞瘤为人胶质母细胞瘤或小鼠胶质母细胞瘤。