[发明专利]一种利用氧气冷等离子体诱变创制结缕草突变体的方法

权利要求书

1.一种利用氧气冷等离子体诱变创制结缕草突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用结缕草的幼嫩分蘖芽诱导体细胞组织，对诱导的体细胞组织进行冷等离子体诱变，得诱变体；所述冷等离子体诱变在真空条件下进行，且在进行诱变时通入放电气体氧气10～12min，压强为15～30Pa，处理功率为600～750W，诱变8～12min；

(2)将所述诱变体依次进行分化培养和生根培养，得诱变植株；

(3)对所述诱变植株进行表型和SRAP分子鉴定，得变异植株；对所述变异植株进行扦插繁殖，鉴定突变性状，获得稳定遗传的突变体；

步骤(1)所述诱导包括将消毒后的幼嫩分蘖芽接种到诱导培养基中进行诱导，获得体细胞组织；所述诱导培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：2,4-D 6～8mg/L、L-脯氨酸4～5g/L、5-氨基乙酰丙酸5～7mg/L、VB₁2～3mg/L、蔗糖25～30g/L和植物凝胶3～5g/L；

所述消毒包括：用质量百分含量为15％的H₂O₂水溶液浸泡所述幼嫩分蘖芽10～15min，蒸馏水冲洗3～5min，然后用体积百分含量为50％的乙醇水溶液浸泡8～12min，蒸馏水冲洗10～15min；

步骤(1)所述冷等离子体诱变时，取直径0.4～0.7cm的颗粒状体细胞组织，置于直径6cm的石英玻璃培养皿中，将培养皿置于射频放电两块极板中间，距电极板的距离为1～2cm。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)所述诱导在暗环境中进行，温度为25±1℃，诱导的时间为20～30d。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)所述分化培养为暗培养，所述暗培养的温度为25±1℃，暗培养的时间为30d；

所述分化培养用培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：NAA 0.3～0.5mg/L、5-氨基乙酰丙酸1～3mg/L、蔗糖25～30g/L和植物凝胶3～5g/L。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)所述生根培养为光暗交替培养，光周期为12h/d，光照强度为2000～2500Lx，所述生根培养的温度为25±1℃，培养时间为10～15d；

所述生根培养用培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：GR₂₄0.5～1.0μg/L、IBA 0.1～0.2mg/L、蔗糖25～30g/L和植物凝胶3～5g/L。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(3)所述表型包括叶长、叶宽、节间长度、节间直径和草层高度。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(3)所述SRAP分子鉴定包括利用20对SRAP引物对对所述诱变植株与正常植株进行PCR扩增；所述20对SRAP引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.40所示。