[发明专利]科博肽中杂质的鉴定方法及科博肽纯度的检测方法

说明书

本发明公开了科博肽中杂质的鉴定方法及科博肽纯度的检测方法，其是基于CESI‑MS法对科博肽中主要成分及杂质进行鉴定，并基于CE‑UV法对科博肽含量或纯度进行检测；且CESI‑MS法与CE‑UV法的出峰顺序及峰型一致。该方法分析速度快，分离时间低至3min；分离度高；灵敏度高，可达到2.50ug/mL。利用该方法可以快速、高效地对科博肽的纯度进行分析，从而能够更好地对科博肽的质量一致性进行有效控制。该方法已成功应用于不同批次科博肽样品的一致性分析中，对科博肽纯化工艺具有指导意义，有望进一步应用于其他难分离多肽药物的杂质鉴定及纯度分析研究中。

技术领域

本发明涉及生物制品质量控制技术领域，具体地说，涉及科博肽中杂质的鉴定方法及科博肽纯度的检测方法。

背景技术

科博肽是从中华眼镜蛇的蛇毒中提取获得的一种含有多种组分的多肽类药物，是一种治疗多种慢性疼痛的强效非成瘾性镇痛药。因其具有镇痛持久、成瘾性低而被广泛应用于慢性、顽固性、持续性疼痛的临床治疗中，如晚期肿瘤疼痛、三叉神经痛以及慢性关节痛等。科博肽制备的过程主要通过凝胶色谱分离的方式进行纯化，其产品中可能存在较多的与主成分分子量相近(如脱酰胺化、序列错配等)，结构与色谱性质高度相似的杂质。目前提取多肽药物的纯度分析主要采用HPLC方法，然而采用科博肽现行质量标准中基于HPLC的纯度分析方法，无法实现主成分与杂质之间的有效分离。因此，该方法对其杂质进行准确定性与定量分析难度较大，进而导致制剂的质量一致性与临床用药的安全性难以保证。

为能够实现对难分离多肽类药物的纯度分析与质量控制，亟需开发一种高效准确的多肽药物分析方法。毛细管电泳因其操作简单、样品和缓冲液用量少、分离速度快、分离效率高、分离模式多样等优点，是多肽定性定量分析的常用手段。近年来，毛细管电泳质谱联用技术作为一种新兴的方法，有效结合了毛细管电泳的高分离效率和质谱高灵敏的特点，在多肽、蛋白的表征中逐渐受到关注。无鞘液毛细管电泳质谱联用技术(CESI-MS毛细管电泳电喷雾离子化技术)最早是由Moini等人提出，通过将分离毛细管末端加工成纳升电喷雾喷针，系统通过另一根毛细管将导电液输送到喷针导电部分外侧，完成毛细管电泳和电喷雾的电连接。由于无需使用鞘液辅助导电，从毛细管内分离得到的分析物可以直接进入ESI离子源，没有鞘液的稀释和干扰，从而能够保证分析物的高浓度效果，极大程度提高了质谱的检测灵敏度。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速、高效的科博肽中杂质的鉴定方法及科博肽纯度的检测方法。

本发明构思如下：本发明基于CESI-MS和CE-UV方法对科博肽进行了杂质研究，依赖于CE的高效分离能力和MS强大的鉴定能力，利用CESI-MS方法可有效确定科博肽主成分的峰。CE技术具有分离效率高、分离速度快，检测灵敏度高的优势，利用CE-UV方法可以对科博肽的杂质进行快速准确定量。科博肽样品通过CESI-MS与CE-UV方法获得的峰型一致。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供科博肽中杂质的鉴定方法及科博肽纯度的检测方法，其特征在于，基于CESI-MS法对科博肽中主要成分及杂质进行鉴定，并基于CE-UV法对科博肽含量或纯度进行检测；且CESI-MS法与CE-UV法的出峰顺序及峰型一致。

前述的方法，将科博肽样品溶于缓冲液中配制成样品溶液，进行CESI-MS检测，得到CESI-MS分析谱图中至少包含1、2、3、4号峰，其中2号峰为主成分峰，1、3和4号峰为杂质峰；3号峰为脱酰胺化产物的降解峰。

各峰对应的分子量如下：

2号峰：6948.24Da；

1号峰：6850.33Da；

3号峰：6949.17Da；

4号峰：7007.36Da。