[发明专利]一种人神经丝轻链的原核表达载体构建及蛋白的纯化方法

说明书

本发明公开了一种人神经丝轻链的原核表达载体构建及蛋白的纯化方法，通过基因合成技术将重组NEFL密码子优化后亚克隆至pET‑22b(+)，pET‑32a(+)和pSmart‑I中，构建重NEFL质粒；利用构建好的重NEFL质粒制备表达载体转化表达菌感受态细胞；利用菌落SDS‑PAGE方法，鉴定目的蛋白是否在大肠杆菌中大量表达；再根据SDS‑PAGE结果，判断目的蛋白是以包涵体还是以可溶性蛋白的形式产生，确定最适的上清表达诱导条件；最后纯化目的蛋白并将纯化后的目的蛋白进行透析、浓缩；本发明对基因进行密码子优化，运用不同的表达载体，进行了最优克隆的筛选及最优表达时间的优化，提高了该蛋白的上清表达量。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的，涉及一种人神经丝轻链的原核表达载体构建及蛋白的纯化方法。

背景技术

神经中间丝或称神经纤维丝包括3个亚基∶神经丝轻链(neurofilament lightpolypeptide，NEFL)、神经丝中链(NEFM)和神经丝重链(NEFH)，相对分子质量分别为68，000、160，000和212，000。NEFL是唯一可以自我组装的亚单位，NEFL在体外可自我组装成同型多聚体的10nm的纤维，当NEFL亚单位缺少时，神经丝中链多肽和神经丝重链多肽亚单位不能组装成功能性神经丝蛋白，因而NEFL被认为是最重要的神经纤维丝。

NEFL是组成神经细胞骨架的关键成分，并与对神经细胞塑形至关重要的多个蛋白靶点有相互联系，在维持神经细胞形态及使有髓鞘的轴突再生方面起关键性作用。近年来发现，NEFL与神经系统相关疾病的关系密切，是阿尔茨海默病、脑震荡、帕金森氏综合征等脑部病变的血液生物标志物，也发现NEFL可能与神经系统以外肿瘤的发生、发展密切相关，如乳腺癌、肺癌、头颈部肿瘤等。因此，采用具有高灵敏度和高特异性的检测NEFL方法在相关人群中进行筛查，对相关疾病的诊断具有重大意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人神经丝轻链的原核表达载体构建及蛋白的纯化方法。

本发明需要解决的技术问题为：

近年来发现，NEFL与神经系统相关疾病的关系密切，是阿尔茨海默病、脑震荡、帕金森氏综合征等脑部病变的血液生物标志物，也发现NEFL可能与神经系统以外肿瘤的发生、发展密切相关，如乳腺癌、肺癌、头颈部肿瘤等。因此，采用具有高灵敏度和高特异性的检测NEFL方法在相关人群中进行筛查，对相关疾病的诊断具有重大意义。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种人神经丝轻链的原核表达载体构建及蛋白的纯化方法，具体包括如下步骤：

1重组质粒构建：通过基因合成技术将重组NEFL密码子优化后亚克隆至pET-22b(+)，pET-32a(+)和pSmart-I中，构建重NEFL质粒；

2转化表达茵：利用构建好的重NEFL质粒制备表达载体转化表达菌感受态细胞；

3目的蛋白的诱导表达：首先制备空白对照组和诱导组菌体，利用菌落SDS-PAGE方法，鉴定目的蛋白是否在大肠杆菌BL21中大量表达；再根据SDS-PAGE结果，判断目的蛋白是以包涵体还是以可溶性蛋白的形式产生，确定最适的上清表达诱导条件；最后纯化目的蛋白；

4蛋白的透析和浓缩：将纯化后的目的蛋白进行透析、浓缩，做好收集存储。

进一步地，所述重NEFL质粒表达的重组蛋白序列为：