[发明专利]一种人神经丝轻链的原核表达载体构建及蛋白的纯化方法在审
申请号: | 202110213861.8 | 申请日: | 2021-02-25 |
公开(公告)号: | CN112980861A | 公开(公告)日: | 2021-06-18 |
发明(设计)人: | 张志鹏;沈健;蒋克雪 | 申请(专利权)人: | 安徽环球基因科技有限公司 |
主分类号: | C12N15/70 | 分类号: | C12N15/70;C07K14/47;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/16;C12R1/19 |
代理公司: | 合肥正则元起专利代理事务所(普通合伙) 34160 | 代理人: | 刘生昕 |
地址: | 239000 *** | 国省代码: | 安徽;34 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 神经 丝轻链 表达 载体 构建 蛋白 纯化 方法 | ||
1.一种人神经丝轻链的原核表达载体构建及蛋白的纯化方法,其特征在于,具体包括如下步骤:
1重组质粒构建:通过基因合成技术将重组NEFL密码子优化后亚克隆至pET-22b(+),pET-32a(+)和pSmart-I中,构建重NEFL质粒;
2转化表达茵:利用构建好的重NEFL质粒制备表达载体转化表达菌感受态细胞;
3目的蛋白的诱导表达:首先制备空白对照组和诱导组菌体,利用菌落SDS-PAGE方法,鉴定目的蛋白是否在大肠杆菌BL21中大量表达;再根据SDS-PAGE结果,判断目的蛋白是以包涵体还是以可溶性蛋白的形式产生,确定最适的上清表达诱导条件;最后纯化目的蛋白;
4蛋白的透析和浓缩:将纯化后的目的蛋白进行透析、浓缩,做好收集存储。
2.根据权利要求1所述的一种人神经丝轻链的原核表达载体构建及蛋白的纯化方法,其特征在于,所述重NEFL质粒表达的重组蛋白序列为:
MSSFSYEPYYSTSYKRRYVETPRVHISSVRSGYSTARSAYSSYSAPVSSSLSVRRSYSSSSGSLMPSLENLDLSQVAAISNDLKSIRTQEKAQLQDLNDRFASFIERVHELEQQNKVLEAELLVLRQKHSEPSRFRALYEQEIRDLRLAAEDATNEKQALQGEREGLEETLRNLQARYEEEVLSREDAEGRLMEARKGADEAALARAELEKRIDSLMDEISFLKKVHEEEIAELQAQIQYAQISVEMDVTKPDLSAALKDIRAQYEKLAAKNMQNAEEWFKSRFTVLTESAAKNTDAVRAAKDEVSESRRLLKAKTLEIEACRGMNEALEKQLQELEDKQNADISAMQDTINKLENELRTTKSEMARYLKEYQDLLNVKMALDIEIAAYRKLLEGEETRLSFTSVGSITSGYSQSSQVFGRSAYGGLQTSSYLMSTRSFPSYYTSHVQEEQIEVEETIEAAKAEEAKDEPPSEGEAEEEEKDKEEAEEEEAAEEEEAAKEESEEAKEEEEGGEGEEGEETKEAEEEEKKVEGAGEEQAAKKKD。
3.根据权利要求1所述的一种人神经丝轻链的原核表达载体构建及蛋白的纯化方法,其特征在于,所述转化表达茵的具体步骤如下:参考碧云天超级感受态制备试剂盒技术,制备出感受态细胞,然后将构建好的1μL重NEFL质粒分别加入至100μL的感受态细胞中,轻轻混合均匀,置于冰上30min,再于42℃水浴条件下,热激90s后立即转移至冰上放置5min,得第一混合物,向第一混合物中加入500μL的预热LB培养基,所述预热LB培养基为37℃水浴下放置2-3min后的LB培养基,然后于37℃下振荡培养1h,取出200μL培养的菌体,用涂布棒将其均匀涂在含有相应抗性的LB琼脂平板中,于温度为37℃下,倒置培养过夜。
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