[发明专利]一种人神经丝轻链的原核表达载体构建及蛋白的纯化方法

权利要求书

1.一种人神经丝轻链的原核表达载体构建及蛋白的纯化方法，其特征在于,具体包括如下步骤：

1重组质粒构建：通过基因合成技术将重组NEFL密码子优化后亚克隆至pET-22b(+)，pET-32a(+)和pSmart-I中，构建重NEFL质粒；

2转化表达茵：利用构建好的重NEFL质粒制备表达载体转化表达菌感受态细胞；

3目的蛋白的诱导表达：首先制备空白对照组和诱导组菌体，利用菌落SDS-PAGE方法，鉴定目的蛋白是否在大肠杆菌BL21中大量表达；再根据SDS-PAGE结果，判断目的蛋白是以包涵体还是以可溶性蛋白的形式产生，确定最适的上清表达诱导条件；最后纯化目的蛋白；

4蛋白的透析和浓缩：将纯化后的目的蛋白进行透析、浓缩，做好收集存储。

2.根据权利要求1所述的一种人神经丝轻链的原核表达载体构建及蛋白的纯化方法，其特征在于，所述重NEFL质粒表达的重组蛋白序列为：

MSSFSYEPYYSTSYKRRYVETPRVHISSVRSGYSTARSAYSSYSAPVSSSLSVRRSYSSSSGSLMPSLENLDLSQVAAISNDLKSIRTQEKAQLQDLNDRFASFIERVHELEQQNKVLEAELLVLRQKHSEPSRFRALYEQEIRDLRLAAEDATNEKQALQGEREGLEETLRNLQARYEEEVLSREDAEGRLMEARKGADEAALARAELEKRIDSLMDEISFLKKVHEEEIAELQAQIQYAQISVEMDVTKPDLSAALKDIRAQYEKLAAKNMQNAEEWFKSRFTVLTESAAKNTDAVRAAKDEVSESRRLLKAKTLEIEACRGMNEALEKQLQELEDKQNADISAMQDTINKLENELRTTKSEMARYLKEYQDLLNVKMALDIEIAAYRKLLEGEETRLSFTSVGSITSGYSQSSQVFGRSAYGGLQTSSYLMSTRSFPSYYTSHVQEEQIEVEETIEAAKAEEAKDEPPSEGEAEEEEKDKEEAEEEEAAEEEEAAKEESEEAKEEEEGGEGEEGEETKEAEEEEKKVEGAGEEQAAKKKD。

3.根据权利要求1所述的一种人神经丝轻链的原核表达载体构建及蛋白的纯化方法，其特征在于，所述转化表达茵的具体步骤如下：参考碧云天超级感受态制备试剂盒技术，制备出感受态细胞，然后将构建好的1μL重NEFL质粒分别加入至100μL的感受态细胞中，轻轻混合均匀，置于冰上30min，再于42℃水浴条件下，热激90s后立即转移至冰上放置5min，得第一混合物，向第一混合物中加入500μL的预热LB培养基，所述预热LB培养基为37℃水浴下放置2-3min后的LB培养基，然后于37℃下振荡培养1h，取出200μL培养的菌体，用涂布棒将其均匀涂在含有相应抗性的LB琼脂平板中，于温度为37℃下，倒置培养过夜。