[发明专利]人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的重组表达及其应用

说明书

本发明公开了人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的重组表达及其应用，具体的，提供了一种表达量高，免疫原性好，纯度高的真核重组MOG蛋白的制备方法，本发明运用基因工程技术，克隆得到MOG基因的胞外段，连接到表达载体上再转化入宿主细胞表达纯化大量稳定的MOG蛋白，为MOG抗体的体外诊断提供了基础。本发明在基因合成的过程中对MOG的基因进行了密码子的优化，运用了3个不同的信号肽最优表达时间的优化，确定了上清表达的最佳收样时间，本发明在纯化的缓冲液中加入了10％的乙醇，成功避免了蛋白聚集的情况，且在最终MOG表达的活性鉴定中，表达的MOG蛋白，可以准确的区分临床上MOG‑IgG的阳性和阴性样本。

技术领域

本发明属于生物蛋白重组表达技术领域，具体的，涉及一种人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的重组表达及其应用。

背景技术

髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glyco-protein，MOG)为少突胶质细胞膜结合糖蛋白，是中枢神经髓鞘的重要组成部分，研究显示抗MOG抗体在多发性硬化(multiple sclerosis，MS)的病理过程中起着非常重要的作用，由MOG诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental au-toimmune encephalomyelitis，EAE)是目前国际上公认的MS动物模型】。目前国内所使用的MOG多为人工合成的MOC肽段。MOG细胞外Ig样结构域(extracellular immunoglobulin domain ofMOG，MOG'8)含有多个抗原表位，具有很强的免疫原性。

本发明涉及提供一种表达量高，免疫原性好，纯度高的真核重组MOG蛋白的制备方法，本发明运用基因工程技术，克隆得到MOG基因的胞外段，连接到表达载体上再转化入宿主细胞表达纯化大量稳定的MOG蛋白，为MOG抗体的体外诊断提供了基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的重组表达及其应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的重组表达，具体包括如下步骤：

第一步，重组质粒构建

通过基因合成技术将重组MOG的Ig样结构域密码子优化后亚克隆至带有不同信号肽序列的pTT5中，构建重组MOG质粒。

第二步，抽提转染级别质粒

第三步，转染

S1、转染Expi293F^TM细胞的前准备

S2、转染Expi293F^TM细胞

S21、转染前一天(第-1天)，将Expi293F^TM培养物分裂成2.5–3×106活细胞/mL的最终密度，并使细胞生长过夜；

S22、用预热至37℃的新鲜Expi293^TM表达培养基将步骤S21中的细胞稀释至3×106活细胞/mL的终密度，轻轻摇动烧瓶以混合细胞；

S23、制备ExpiFectamine^TM293/质粒DNA复合物；

S24、在室温下孵育步骤S23中的步骤d制备的ExpiFectamine^TM293/质粒DNA复合物10–20分钟，然后将溶液缓慢转移至步骤4的摇瓶中，在添加过程中轻轻摇动烧瓶；

S25、在37℃的培养箱中，8％CO₂的潮湿环境中孵育细胞在轨道振动筛上的空气中；

S26、转染第三天开始收集0.3mL培养物，3000r/min,4度离心5min，将培养基上清加2×SDS Loading buffer，水浴锅中煮沸5min；