[发明专利]人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的重组表达及其应用

权利要求书

1.人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的重组表达，其特征在于，具体包括如下步骤：

第一步，重组质粒构建

通过基因合成技术将重组MOG的Ig样结构域密码子优化后亚克隆至带有不同信号肽序列的pTT5中，构建重组MOG质粒。

第二步，抽提转染级别质粒

第三步，转染

S1、转染Expi293F^TM细胞的前准备

S2、转染Expi293F^TM细胞

S21、转染前一天，将Expi293F^TM培养物分成2.5–3×10⁶细胞/mL的最终密度，并使细胞生长过夜；

S22、用预热至37℃的新鲜Expi293^TM表达培养基将步骤S21中的细胞稀释至3×10⁶细胞/mL的终密度，轻轻摇动烧瓶以混合细胞；

S23、制备ExpiFectamine^TM293/质粒DNA复合物；

S24、在室温下孵育步骤S23中的步骤d制备的ExpiFectamine^TM293/质粒DNA复合物10–20分钟，然后将溶液缓慢转移至步骤4的摇瓶中，在添加过程中轻轻摇动烧瓶；

S25、在37℃的培养箱中，8％CO₂的潮湿环境中孵育细胞在轨道振动筛上的空气中；

S26、转染第三天开始收集0.3mL培养物，3000r/min,4度离心5min，将培养基上清加2×SDS Loading buffer，水浴锅中煮沸5min；

S27、连续取样4天，将制备的样本进行WB检测，验证上清液表达的情况；

第四步，纯化目的蛋白

(1)取1mL镍NTA琼脂糖凝胶FF预装柱，用10mL1*PBS，10％乙醇，pH 7.4冲洗预装柱；

(2)将培养上清样品添加乙醇，至终浓度10％；然后用0.22微米l微孔滤膜过滤，然后以0.5mL/min上样，收集流出液，将流出液再次上样，使蛋白样品充分结合到凝胶上；

(3)用30mL超声破碎缓冲液去洗未吸附的样品，流速1-2mL/min；

(4)分别用30mL Wash buffer洗去未吸附的样品，流速1-2mL/min；

(5)用1mL Elution buffer将靶蛋白洗脱下来，流速1-2mL/min；

(6)再用50mL超声破碎缓冲液冲洗柱子，灌满20％乙醇，封闭，以备下次使用。

2.根据权利要求1所述的人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的重组表达，其特征在于，第一步中表达的重组蛋白序列为：

MASLSRPSLPSCLCSFLLLLLLQVSSSYAGQFRVIGPRHPIRALVGDEVELPCRISPGKNATGMEVGWYRPPFSRVVHLYRNGKDQDGDQAPEYRGRTELLKDAIGEGKVTLRIRNVRFSDEGGFTCFFRDHSYQEEAAMELKVEDPFYWVSPGHHHHHHHH。

3.根据权利要求2所述的人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的重组表达，其特征在于，pTT5所带信号肽的序列分别为：

MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSG、MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC与MOG蛋白自身的信号肽。