[发明专利]一种特异识别整合素β3亚基蛋白的核酸适体及其应用

说明书

本发明涉及一种特异识别整合素β3亚基蛋白的核酸适体，所述核酸适体选自如SEQ ID NO.1‑10所示的序列；或选自如SEQ ID NO.1‑10所示序列经标记修饰后的序列；或选自如SEQ ID NO.1‑10所示序列经取代、缺失或添加若干核苷酸后的序列。本发明中的核酸适体相较于传统的抗体，具有很多优势：无免疫原性，不易失活，容易合成和修饰，能批量生产，能快速的穿透组织和良好的代谢动力学，产品批次间差异小和具有很好的化学稳定性。利用本发明的短链核酸适体并加以修饰标记，可以对整合素β3亚基蛋白进行识别检测，且过程快速、简便，对恶性肿瘤骨转移的早期检测及临床治疗提供了新思路。

技术领域

本发明涉及蛋白检测技术领域，尤其涉及一种特异识别整合素β3亚基蛋白的核酸适体及其应用。

背景技术

肿瘤细胞分泌的外泌体(tumor derived-exosomes，TDEs)在肿瘤的亲器官性转移中发挥重要“桥梁”作用。TDEs膜表面带有肿瘤细胞的表面特征，也带有与待转移器官结合的特征。外泌体膜上的整合素介导了转移的亲器官性，整合素α2bβ3、αvβ3与骨转移的亲器官性相关。整合素αvβ3和α2bβ3可以与骨桥蛋白(OPN)、骨涎蛋白(BSP)和纤连蛋白(FN)等骨基质细胞因子结合，促进骨基质微环境与肿瘤细胞的黏附作用。B16黑色素瘤细胞注入β3+/+和β3-/-小鼠的左心室，发现74％的β3+/+小鼠在14天内发生溶骨性骨转移，而只有4％的β3-/-小鼠发生骨病变。因此，TDEs膜上整合素β3亚基可能介导肺癌的亲骨转移。

整合素β3亚基蛋白的识别方法常规为多克隆或单克隆抗体标记技术，即通过抗原抗体特异性结合的原理识别细胞表面或膜表面的整合素β3亚基蛋白。抗体的生产需要复杂的基因工程技术，生产成本高；同时，在使用中，存在批间差异大、有免疫原性、组织通透性差以及稳定性差等缺点。

核酸适体可描述为“化学抗体”。它是通过指数富集的配体系统进化法从DNA/RNA文库中筛选出来的单链寡核酸分子(ssDNA或ssRNA)。通过分子内碱基堆积、疏水、氢键和静电等作用力折叠成独特的分子结构，核酸适体可高特异性和亲和力识别其靶标分子。相较于基因工程的复杂技术而言，核酸适体不但可以通过自动化的固相合成方法制备，而且可以通过核酸组装和化学交联技术合成制备多功能分子识别探针。同时，核酸适体还具有批次间差异小、无免疫原性、快速的组织通透性等优点。因此，核酸适体作为潜在的治疗药物吸引着研究者的注意。

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种特异识别整合素β3亚基蛋白的核酸适体及其应用。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种特异识别整合素β3亚基蛋白的核酸适体及其应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

本发明的第一方面是提供一种特异识别整合素β3亚基蛋白的核酸适体，所述核酸适体选自如SEQ ID NO.1-10所示的序列；或选自如SEQ ID NO.1-10所示序列经标记修饰后的序列；或选自如SEQ ID NO.1-10所示序列经取代、缺失或添加若干核苷酸后的序列。

优选地，将所合成的整合素β3亚基蛋白的核酸适体随机DNA文库，依次采用整合素β3亚基纯蛋白筛选、采用整合素β3高表达细胞NCI-H460正筛选、采用整合素β3不表达细胞Hela负筛选，即得如SEQ ID NO.1-10所示的序列。

优选地，所述标记修饰选自荧光标记、放射性标记、治疗性标记、生物素标记或酶标记。

优选地，所述标记修饰为荧光标记。

本发明的第二方面是提供一种采用如上所述核酸适体特异识别整合素β3亚基蛋白的方法，将分散于结合缓冲液中的待测细胞样品与所述核酸适体摇床孵育，孵育完成后采用洗涤缓冲液离心清洗，清洗完成后通过流式细胞仪检测即可。