[发明专利]一种早期快速检测苹果霉心病菌的引物组、试剂盒及其检测方法和应用

说明书

本发明涉及分子生物学检测技术领域，公开了一种早期快速检测苹果霉心病菌的引物组和包括该引物组的试剂盒，所述引物组包括通用引物对和特异性引物对，所述通用引物对包括上游引物ITS1与下游引物ITS4；所述特异性引物对包括上游引物A1F与下游引物A4R；本发明还提供一种早期快速检测苹果霉心病菌的方法，包括以下步骤：S1.提取样本DNA；S2.PCR反应；S3.结果分析；本发明的有益效果是：通过通用引物对和特异性引物对，采用特定的PCR扩增，并对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳和紫外光照射检测，检测周期最长为7h，检测准确率高达99％，检测最低DNA质量浓度是10pg/μl，并且能特异性检测链格孢菌。

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体是一种早期快速检测苹果霉心病菌的引物组、试剂盒及其检测方法和应用。

背景技术

苹果属(Malus Mill.)是蔷薇科中经济价值较高的植物，包括如苹果、垂丝海棠、山定子、湖北海棠、西府海棠等是重要的园林树种，在北温带，亚洲、欧洲以及北美洲均有分布。苹果是世界上五大果树(柑橘、苹果、香蕉、葡萄、梨)之一，目前，苹果生产已成为许多国家主要的农事活动，全球约有80多个国家和地区从事苹果生产，年产量超过或接近100万吨的主产国有12个，按产量排，依次为中国(46％)、美国(9％)、土耳其(6％)、意大利(5％)、法国(5％)、波兰(5％)、德国(3％)俄罗斯(3％)等。我国是世界上最大的苹果生产国和消费国，苹果种植面积和产量均占世界总量的40％以上，在世界苹果产业中占有重要地位。

苹果霉心病又称心腐病、霉腐病、红腐病、果腐病，是苹果果实生长前期、采收期、贮藏期的主要病害之一。果实受害从心室开始，逐渐向外扩展霉烂。霉心病是一种隐蔽性极强的果实病害，其发病特征是花期开始染病，病菌在心室中潜伏，一般在生长季节不发病，近成熟期果树内部霉变，外表仍然正常，因此果实外面很难看出。危害严重时，采收期霉心病发病率可达70％～80％，苹果霉心病可造成苹果果肉腐烂且发苦，还会引起早期果实的大量脱落，最终导致产量下降和销量减少，给果农造成严重的经济损失。

苹果霉心病的病原种类较多，包括链格孢、粉红单端孢和镰刀菌属等真菌，其中，链格孢菌的比例最多，占50以上，而苹果霉心病病菌自花期花瓣张开就开始侵染花柱等花器。目前，鉴定苹果霉心病病原，主要是采集苹果霉心病病果，切开后通过常规分离培养，进一步对病原菌的菌落、菌丝、孢子的形态进行观察，甚至结合分子鉴定手段才能确定其病原菌。该方法不仅耗时、操作繁琐，还不能在早期判断苹果是否被病菌感染。

发明内容

本发明的目的之一在于克服现有技术的不足，提供一种早期快速检测苹果霉心病菌的引物组，以至少达到高灵敏度和高特异性的目的。

上述目的是通过以下技术方案实现的：一种早期快速检测苹果霉心病菌的引物组，包括通用引物对和特异性引物对；

所述通用引物对包括上游引物ITS1与下游引物ITS4，所述上游引物ITS1的序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物ITS4的序列如SEQ ID NO.2所示；

所述的特异性引物对包括上游引物A1F与下游引物A4R，所述上游引物A1F的序列如SEQ ID NO.3，所述的下游引物A4R的序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明的目的之二在于提供一种包含上述引物组的早期快速检测苹果霉心病菌的试剂盒。

本发明的目的之三在于提供一种使用上述引物组早期快速检测苹果霉心病菌的方法。

上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种早期快速检测苹果霉心病菌的方法，包括以下步骤：

S1.提取样本DNA；

S2.采用所述引物组对样本DNA进行PCR反应，得到扩增产物；

S3.对所述扩增产物进行分析。