[发明专利]一种早期快速检测苹果霉心病菌的引物组、试剂盒及其检测方法和应用

权利要求书

1.一种早期快速检测苹果霉心病菌的引物组，其特征在于，包括通用引物对和特异性引物对；

所述通用引物对包括上游引物ITS1与下游引物ITS4，所述上游引物ITS1的序列如SEQID NO.1所示，所述下游引物ITS4的序列如SEQ ID NO.2所示；

所述的特异性引物对包括上游引物A1F与下游引物A4R，所述上游引物A1F的序列如SEQID NO.3，所述的下游引物A4R的序列如SEQ ID NO.4所示。

2.一种包含权利要求1所述的引物组的早期快速检测苹果霉心病菌的试剂盒。

3.一种使用权利要求1所述的引物组早期快速检测苹果霉心病菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.提取样本DNA；

S2.采用所述引物组对样本DNA进行PCR反应，得到扩增产物；

S3.对所述扩增产物进行分析。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，S1中，所述提取样本DNA，是选取待测的苹果花瓣，采用真菌DNA提取法对其进行处理，得到样本DNA。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，S2中，所述PCR反应为巢式PCR反应。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述巢式PCR反应，包括以下步骤：

1)采用所述通用引物对对样本DNA进行第一次PCR扩增，得到扩增初产物；

2)采用所述特异性引物对对扩增初产物进行第二次PCR扩增，得到扩增产物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述第一次PCR扩增的反应体系为：TaqMix：12.5μl，ITS1：1μl，ITS4：1μl，样本DNA：1μl，ddH₂O：9.5μl；

和/或，所述第一次PCR扩增的反应条件为：98℃预变性3min；98℃20s，57℃20s，72℃30s，30个循环；72℃延伸10min；

和/或，所述第二次PCR扩增的反应体系为：Taq Mix：12.5μl，A1F：1μl，A4R：1μl，扩增初产物：1μl，ddH₂O：9.5μl；

和/或，所述第二次PCR扩增的反应条件为：98℃预变性3min；98℃20s，59℃20s，72℃20s，30个循环；72℃延伸10min。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，S3中，所述分析，包括以下步骤：

1)对所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到电泳产物；

2)将所述电泳产物染色和静置后，再进行紫外光照射检测，判定是否存在目的条带。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述目的条带的大小为446bp。

10.如权利要求1所述的引物组或权利要求2所述的试剂盒或权利要求3～9任一项所述的方法在早期快速检测苹果霉心病菌中的应用。