[发明专利]一种高表达N-糖基化抗VEGFR2单体拟抗体的重组渗漏菌株、其构建方法及应用

说明书

本发明公开了一种高表达N‑糖基化抗VEGFR2单体拟抗体的重组渗漏菌株、其构建方法及应用，其目的是提供一种可利用大肠埃希菌胞外高效生产N‑糖基化抗VEGFR2单体拟抗体药物蛋白及糖疫苗的方法，属于生物技术领域。主要步骤包括在敲除大肠埃希菌外膜脂蛋白lpp基因的大肠埃希菌菌株中利用基于pglB的N‑糖基化机制及自动诱导方法表达N‑糖基化修饰的抗VEGFR2单体拟抗体。该方法可实现N‑糖基化抗VEGFR2单体拟抗体产量的增加，降低了外源基因表达产物在质周腔过度积累所造成的代谢负荷，无需破碎细菌而从培养基中直接分离纯化N‑糖基化蛋白，简化了分离纯化步骤，易于大规模产业化生产。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种高表达N-糖基化抗VEGFR2单体拟抗体的重组渗漏菌株、其制备方法，利用大肠埃希菌胞外生产可增加N-糖基化抗VEGFR2单体拟抗体产量的应用。

背景技术

目前生产重组蛋白的最常见宿主菌是大肠埃希菌(Escherichia coli)，它具有生长周期短、成本低和适合工业化生产等特点。但天然的大肠埃希菌缺乏蛋白质糖基化修饰机制，是限制其广泛应用的主要原因。近十年来应用以大肠埃希菌为代表的原核表达系统来生产糖蛋白日益成熟，标志着利用大肠埃希菌定制生产糖蛋白时代的到来。

单体拟抗体(Monobody)是利用噬菌体展示技术等对人纤维连接蛋白III型结构域的第10重复序列区蛋白(fibronectin type III，FN3骨架蛋白)改造发展而来的抗体类似物，具有免疫原性弱，组织穿透力强，具有高亲合力和高特异性，并且易于在大肠埃希菌中低成本、快速、大量制备的特点。然而因为分子量较小(10kDa)，易降解，血清半衰期短。文献显示目前研究通常采用带有较强启动子的载体如pET28等进行胞质内表达，容易形成包涵体，复性困难，蛋白稳定性差，造成蛋白产量低，成药性差的现状。目前临床还没有Monobody类药物通过美国FDA认证。

大肠埃希菌具有细胞外膜和内膜结构，可以将其分为三个区域：胞质内、质周腔、细胞外。通常设计目标蛋白在质周腔表达，产物持续、快速累积，增加了质周腔的代谢负担，不利于重组蛋白的稳定持续表达；另外基于pglB的N-糖基化修饰必须是在质周腔中完成，有限的空间也影响了重组糖蛋白表达的总产量及糖基化修饰的效率。

构建遗传渗漏菌株是将重组蛋白分泌到培养基中的首选方法。大肠埃希菌重组蛋白的胞外分泌表达提供了一种有效的策略，具有许多优点，如减轻菌体代谢压力，提高产物稳定性，简化下游处理工艺等。本课题组前期实验证实大肠埃希菌CLM37Δlpp菌株中敲除lpp可以通过增加外膜的通透性来提高重组蛋白的产量。但目前鲜见利用大肠埃希菌渗漏菌株进行单体拟抗体类糖蛋白药物生产的报导，也未见针对胞外分泌目标糖蛋白的糖基化效率及生物活性的研究。

发明内容

针对现有技术中的不足之处，本发明提供了一种应用渗漏菌株提高N-糖基化抗VEGFR2单体拟抗体产量的方法。本发明通过应用前期构建的敲除胞膜脂蛋白lpp基因的大肠埃希菌CLM37Δlpp菌株，结合来源于空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)N-糖基化机制和自动诱导表达方式，采用中等强度启动子构建质周腔表达载体，实现大肠埃希菌胞外生产N-糖基化抗VEGFR2单体拟抗体，重组N-糖基化蛋白高效分泌到培养基中，可提高抗VEGFR2单体拟抗体的产量，同时简化了后续分离纯化低分子量糖蛋白步骤。

本发明第一方面提供了一种高表达N-糖基化抗VEGFR2单体拟抗体的重组渗漏菌株；所述重组渗漏菌株为大肠埃希菌改造菌株CLM37Δlpp中引入含有碱基序列如SEQ IDNO.1所示基因序列的重组载体pIG6-FN3_VEGFR2及空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)来源的N-糖基化基因簇pgl。该重组渗漏菌株在自动诱导条件下能够实现稳定、高效地分泌生产N-糖基化修饰的抗VEGFR2(人血管内皮生长因子受体2)单体拟抗体。且该重组渗漏菌株制备所得的抗VEGFR2单体拟抗体的活性没有影响。