[发明专利]一种高表达N-糖基化抗VEGFR2单体拟抗体的重组渗漏菌株、其构建方法及应用

权利要求书

1.一种高表达N-糖基化抗VEGFR2单体拟抗体的重组渗漏菌株，其特征在于：所述重组渗漏菌株为大肠埃希菌改造菌株CLM37Δlpp中引入含有碱基序列如SEQ ID NO.1所示基因序列的重组载体pIG6-FN3_VEGFR2及空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)来源的N-糖基化基因簇pgl。

2.根据权利要求1所述的高表达N-糖基化抗VEGFR2单体拟抗体的重组渗漏菌株，其特征在于：所述的含有碱基序列如SEQ ID NO.1所示基因片段的重组载体pIG6-FN3_VEGFR2是指在重组载体pIG6-FN3_VEGFR2中表达抗VEGFR2单体拟抗体、并带有糖基化修饰位点，且引入携带空肠弯曲杆菌基于pglB的N-糖基化修饰基因簇的质粒。

3.如权利要求1所述的高表达N-糖基化抗VEGFR2单体拟抗体的重组渗漏菌株的构建方法，其步骤包括：

(1)含有碱基序列如SEQ ID NO.1所示基因片段的重组载体pIG6-FN3_VEGFR2的构建步骤：通过PCR方法在抗VEGFR2单体拟抗体基因5′端、3′端以及柔链区引入M1标签和组氨酸纯化标签及编码不同数量的糖基化识别位点碱基序列，并克隆到pIG6表达载体OmpA信号肽下游，载体命名为pIG6-FN3_VEGFR2；

(2)制备重组渗漏菌株CLM37Δlpp，将pIG6-FN3_VEGFR2-Gly质粒转化到CLM37Δlpp细胞中，获得可高表达抗VEGFR2单体拟抗体的重组渗漏菌株

CLM37Δlpp/pIG6-FN3_VEGFR2-Gly；该重组渗漏菌株进一步转入携带N-糖基化基因簇的pACYCpgl质粒，然后进行自动诱导，用于生产糖基化的FN3_VEGFR2-Gly。

4.如权利要求1所述的重组渗漏菌株在提高N-糖基化抗VEGFR2单体拟抗体产量方面的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：利用权利要求1所述的重组渗漏菌株在自动诱导培养基中诱导胞外生产抗VEGFR2单体拟抗体；收集培养所得的上清液，离心并收集沉淀，纯化后获得N-糖基化抗VEGFR2单体拟抗体。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述自动诱导培养基为：每升培养基中含有胰蛋白胨8～12g，酵母提取物4～6g，甘油4～6g，葡萄糖0.4～0.6g，乳糖1～3g，磷酸氢二钠6～8g，磷酸二氢钾6～8g，硫酸铵3～4g，硫酸钠0.5～1.2g，七水硫酸镁0.2～0.3g。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述诱导培养步骤包括：将权利要求1所述的重组渗漏菌株接种到含有80～120μg/mL氨苄青霉素和35～40μg/mL氯霉素的LB液体培养基，过夜12～18小时培养；再以1:80～120的体积比接种到含有80～120μg/mL氨苄青霉素和35～40μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，直至OD₆₀₀达到0.5～0.8；然后，以1:80～120接种到含有80～120μg/mL氨苄青霉素和35～40μg/mL氯霉素的自动诱导培养基中诱导表达。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述重组渗漏菌株的培养条件为：将共转化有pIG6-rFn3-Gly和pACYCpgl质粒的菌株CLM37Δlpp接种于含有氨苄青霉素、氯霉素的新鲜自动诱导培养基中，连续培养增菌。

9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述离心的条件为：收取诱导至少40小时的菌液于8000～14000r/min，18～22min离心。

10.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述纯化的条件为：①上文离心后获得的上清液加入终浓度为18～22mM的咪唑；②0.22μM滤膜抽滤除杂质，并加入终浓度为280～320mM氯化钠及0.8～1.2wt％的Tween-20，冰浴保存；③装好His-Trap镍柱后，400～600mM咪唑洗脱，洗去残留蛋白；④用由18～22mM咪唑及1～2wt％的Tween-20组成的Bindingbuffer过柱，流速0.8～1.2mL/min清洗；⑤将上清液进行过柱，流速0.8～1.2mL/min；⑥上清液全部过柱后，再用18～22mM的咪唑以1.5～2.5mL/min去除杂蛋白；⑦将镍柱取下，装在干净的注射器上，按40～240mM范围进行梯度洗脱，浓度为400～600mM的咪唑进行蛋白洗脱，收集洗脱液。