[发明专利]鉴别甘蓝枯萎病致病菌生理小种类型的PCR引物及其应用

权利要求书

1.用于鉴别甘蓝枯萎病致病菌尖孢镰刀菌粘团专化型(Fusarium oxysporumf.sp.conglutinans)生理小种的PCR引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为：

上游引物Foc12-F：5'-ATGAACTTGATGGGGTTACCGAT-3'，

下游引物Foc12-R：5'-TTGTATTGCTGTTTGGGTGTACC-3'，

所述PCR引物扩增尖孢镰刀菌粘团专化型两个生理小种基因组，1号生理小种的特征条带大小为225bp，2号生理小种的特征条带大小为174bp。

2.用于鉴别甘蓝枯萎病致病菌生理小种类型的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的PCR引物。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：还包括用于进行PCR扩增和/或PCR扩增产物电泳所需的试剂。

4.权利要求1所述的PCR引物或者权利要求2或3所述的试剂盒在如下(1)-(6)中任一方面的应用：

(1)鉴别或辅助鉴别待测菌株是否为甘蓝枯萎病致病菌；

(2)制备鉴别或辅助鉴别待测菌株是否为甘蓝枯萎病致病菌的产品；

(3)鉴别或辅助鉴别尖孢镰刀菌粘团专化型1号生理小种和/或2号生理小种；

(4)制备鉴别或辅助鉴别尖孢镰刀菌粘团专化型1号生理小种和/或2号生理小种的产品；

(5)检测或辅助检测待测样品是否感染甘蓝枯萎病致病菌；

(6)制备检测或辅助检测待测样品是否感染甘蓝枯萎病致病菌的产品。

5.鉴别甘蓝枯萎病致病菌生理小种类型的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)以待测菌株的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的PCR引物或者权利要求2或3所述的试剂盒进行PCR扩增，得到PCR产物；

(2)电泳检测得到的PCR产物；

(3)比较待测菌株与尖孢镰刀菌粘团专化型标准的1号生理小种和2号生理小种菌株的电泳条带的异同，电泳条带与1号生理小种条带大小一样的待测菌株为1号生理小种，电泳条带与2号生理小种条带大小一样的待测菌株为2号生理小种，所述尖孢镰刀菌粘团专化型1号生理小种和2号生理小种标准菌株的分子标记特征电泳条带分别为225bp和174bp。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR的反应体系中各物质浓度为：含MgCl₂15mmol/L的10×Buffer 0.1μL/μL，含A、G、C、T各2.5mmol/L的dNTP 0.08μL/μL，上下游引物各0.5μmol/L，Taq酶0.1U/μL，模板DNA 5ng/μL，溶剂为双蒸水。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR的反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，53～62℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸5min。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述退火温度为56℃。

9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述电泳为采用4％的聚丙烯酰胺凝胶，于160V恒功率电泳分离70分钟，最后银染显色。