[发明专利]大泷六线鱼的精原细胞培养基及培养方法

说明书

本发明涉及大泷六线鱼的精原细胞培养基及培养方法，属于细胞生物学领域，所述的精原细胞培养基包括以下成分：混合培养基、体积比为1％MEM非必需氨基酸、体积比为1％双抗、体积比为1％鱼血清、生长因子、营养物质、5％胎牛血清。所述的混合培养基为L‑15和DMEM/F12以质量比1：1混合。利用所述培养基和培养方法对体外分离和纯化的大泷六线鱼精原细胞进行培养，能够获得纯度较高且具有干性和增殖活性的精原细胞，为海水鱼类精原细胞移植及精原细胞增殖分化的调控机制研究提供基础实验材料。

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，具体涉及大泷六线鱼精原细胞的体外短期培养的精原细胞培养基及培养方法。

背景技术

精原干细胞(spermatogonial stem cells；SSCs)是一类同时具有增殖和发育潜能的成体干细胞，既能进行有丝分裂形成同样具有干性的精原细胞，又能进行减数分裂在雌性中发育成雌性殖细胞，在雄性中发育成雄性生殖细胞。但精巢中精原干细胞的数量稀少，以成年小鼠为例，精原干细胞的数量仅占精巢总生殖细胞的0.02％～0.03％，因此建立起高效的精原细胞纯化和培养方法至关重要。

大泷六线鱼(Hexagrammos otakii)隶属于鲉形目，六线鱼科、六线鱼属，是一种冷温性近海底层鱼类，是黄海渤海及东海一带常见的经济物种。其肉质鲜美，具有“北方石斑”一称。近年来，由于捕捞过度，大泷六线鱼产量锐减，其大规模人工繁育成为了当务之急。但由于大泷六线鱼产卵量少，且卵排出后20 分钟左右，卵开始显粘性，卵粒之间粘结成块，依附在底层礁岩上，这一特性导致其人工繁育较为困难。研究大泷六线鱼精原细胞的增殖分化过程及其体外培养将会开启其人工繁殖的新方向，避免其受性成熟周期及产卵期的限制，为大规模工厂化养殖提供新的可能。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供大泷六线鱼精原细胞的体外培养的培养基及培养方法，利用所述培养基和培养方法对体外分离、纯化的大泷六线鱼精原细胞进行培养，能够获得纯度较高且具有干性和增殖活性的精原细胞，为海水鱼类精原细胞移植及精原细胞增殖分化的调控机制研究提供基础实验材料。

本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行：

大泷六线鱼的精原细胞培养基，所述的精原细胞培养基包括以下成分：混合培养基、体积比为1％MEM非必需氨基酸、体积比为1％双抗、体积比为1％鱼血清、生长因子、营养物质、5％胎牛血清；所述的混合培养基为L-15和 DMEM/F12以质量比1∶1混合；

所述的生长因子由以下浓度的成分组成：10ng/mL bFGF和10mg/mL GDNF；所述的营养物质由以下浓度的成分组成：10ng/mL牛胰岛素、2mmol/L L-谷氨酰胺和1mmol/L丙酮酸钠。

所述的双抗(BI)为10000units/mL青霉素和10mg/mL链霉素组成的混合抗生素。

本发明还提供一种体外分离、纯化以及培养大泷六线鱼精原细胞的方法，所述方法具体如下：

1)大泷六线鱼精巢组织的取样及消毒：取13～15月龄的雄性大泷六线鱼精巢组织，转移至含10％三抗的1×PBS的培养皿中；

2)精巢细胞的解离：①将精巢组织用含5％三抗的1×PBS清洗2～3次后，去除多余组织；②将处理好的组织于含5％三抗的1×PBS中继续清洗2～3次，转移至小容器中，加入1mL无血清的L-15培养基；③取无菌小剪刀将组织块剪成1mm³的小块，吸取上清液并收集细胞，同时留下组织块，将组织块分装在培养瓶中，加入解离液进行消化；④将组织于28℃摇床消化2h，转速为100 rpm/min；⑤消化后，将混合液过滤去除组织块，并加入等量FBS中和酶反应；⑥400g离心5min两次，去除酶，并加入无血清的L-15培养基重悬得到细胞悬液；