[发明专利]大泷六线鱼的精原细胞培养基及培养方法

权利要求书

1.一种大泷六线鱼的精原细胞培养基，其特征在于所述的精原细胞培养基包括以下成分：混合培养基、体积比为1％MEM非必需氨基酸、体积比为1％双抗、体积比为1％鱼血清、生长因子、营养物质和5％胎牛血清；所述的混合培养基为L-15和DMEM/F12以质量比1：1混合；

所述的生长因子由以下浓度的成分组成:10ng/mLbFGF和10mg/mL GDNF；所述的营养物质由以下浓度的成分组成:10ng/mL牛胰岛素、2mmol/LL-谷氨酰胺和1mmol/L丙酮酸钠。

2.根据权利要求1所述的一种大泷六线鱼的精原细胞培养基，其特征在于所述的双抗为10000units/mL青霉素和10mg/mL链霉素组成的混合抗生素。

3.根据权利要求1所述的大泷六线鱼的精原细胞培养基，其特征在于所述的鱼血清为大泷六线鱼血清。

4.一种体外分离、纯化以及培养大泷六线鱼精原细胞的方法，其特征在于所述方法具体如下：

1)大泷六线鱼精巢组织的取样及消毒：取13～15月龄的雄性大泷六线鱼精巢组织，转移至含10％三抗的1×PBS的培养皿中；

2)精巢细胞的解离：①将精巢组织用含5％三抗的1×PBS清洗2～3次后，去除多余组织；②将处理好的组织于含5％三抗的1×PBS中继续清洗2～3次，转移至小容器中，加入1mL无血清的L-15培养基；③取无菌小剪刀将组织块剪成1mm³的小块，吸取上清液并收集细胞，同时留下组织块，将组织块分装在培养瓶中，加入解离液进行消化；④将组织于28℃摇床消化2h，转速为100rpm/min；⑤消化后，将混合液过滤去除组织块，并加入等量FBS中和酶反应；⑥400g离心5min两次，去除酶，并加入无血清的L-15培养基重悬得到细胞悬液；

3)精原细胞的纯化：①Percoll非连续密度梯度离心，密度梯度为12％、20％、28％，沿管壁向离心管内缓慢加液，先加28％的溶液，再加20％的溶液，最后加12％的溶液，将分离得到的细胞悬液缓慢加于离心管的最顶层；②100g离心30min，精原细胞富集于离心管底部；③加入1×PBS将沉淀重悬，清洗2次，400g离心5min；④用权利要求1所述的精原细胞培养基将沉淀重新悬浮，转移至培养板中，放入培养箱中培养，培养温度为24.8℃；⑤培养24h后，观察到部分支持细胞贴壁，将未贴壁细胞转移至新的培养板中继续培养；⑥继续培养24h后，通过对仍未贴壁的细胞进行碱性磷酸酶染色，观察显色情况判断其是否具有干性，获得纯化后的精原细胞；

4)精原细胞的短期体外培养：收集经上述方法纯化获得的精原细胞，将其置于权利要求1所述的精原细胞培养基上进行培养，定期镜检观察增殖情况并通过碱性磷酸酶染色情况检测其是否具有干性。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的解离液为在含0.05％DNase IL-15培养基的基础上，添加终浓度为1mg/mL胶原酶IV。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的三抗是由10000units/mL青霉素、10mg/mL链霉素、1250units/mL制霉素组成的混合抗生素。