[发明专利]木聚糖酶突变体及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种木聚糖酶突变体及其制备方法与应用，涉及基因工程和遗传工程技术领域。该突变体包括以木聚糖酶HwXyl10A为母本对Gly363位点饱和突变后得到的一种或几种突变体。具体通过定点突变得到了19种突变体，对其进行酵母表达，再通过热稳定新和催化活力筛选，获得2个比活力和热稳定性均显著提高的突变体；本发明通过对Gly363位点的改造可以大大提高木聚糖酶的热稳定新和催化效率，并对第10家族木聚糖酶及其它糖苷水解酶的热稳定性和催化效率改良具有重要的指导意义，还为其在工业生产中的应用提供了基础。

技术领域

本发明涉及基因工程和遗传工程技术领域，涉及一种木聚糖酶突变体及其制备方法与应用，特别是涉及一种高比活耐热木聚糖酶突变体及其制备方法与应用。

背景技术

自然界中50％以上的生物量由纤维素、半纤维素、木质素和果胶等成分组成。木聚糖是半纤维素的主要组成成分之一，是自然界中含量仅次于纤维素的可再生资源，约占地球可再生有机碳的1/3。木聚糖的结构比较复杂，主链是由吡喃木糖以β-D-1,4-木糖苷键连接而成，侧链成分多样，主要包括阿魏酸、α-L-阿拉伯呋喃糖残基、O–乙酰基、香豆酸和葡萄糖醛酸残基等，因此木聚糖的水解需要多种酶的共同参与。

木聚糖酶是水解木聚糖的关键酶，它可以切割木聚糖主链的β-1，4-糖苷键产生小寡糖或者单糖。木聚糖的应用十分广泛，主要包括动物饲料、食品、造纸、啤酒酿造以及绿色能源等领域。木聚糖酶在5、7、8、10、11、16、26、30、43、52和62等11个糖苷水解酶家族(GH)中都有分布，其中GH10和GH11家族的木聚糖酶研究最多，GH10家族木聚糖酶属于(β/α)8–barrel结构，其分子量较GH11家族木聚糖酶高，稳定性强且底物谱广。大部分微生物来源的GH10家族木聚糖酶都在中温(大约40到60℃)中性或者微酸性环境表现出最大活力。在工业应用中，大多数应用环境都属于高温环境，因此获得热稳定性优良且催化活力高的木聚糖酶对工业生产至关重要，目前已经有53个真菌来源木聚糖酶的晶体结构被解析，这为木聚糖酶的性质改良打下了基础。

目前，蛋白质工程在酶分子改良方面应用广泛，即通过对基因或者蛋白本身进行修改或修饰以改变蛋白分子结构从而实现酶功能的改造。蛋白质工程主要用于酶的热稳定性、催化效率、底物特异性和极端环境耐受性等酶学性质的设计和改造。主要涉及的方法有定向进化、理性设计和半理性设计。其中理性设计是一种快速且有效的改造手段，其对蛋白分子结构准确性要求较高。理性设计中常用的方法主要有模块替换和定点突变。如通过该方法，Thermoascus aurantiacus来源的木聚糖酶XynA的热稳定性和pH稳定性得到显著提升。定点饱和突变是理性设计中行之有效的改造方法，通过计算机模拟计算，筛选到与酶功能密切相关的氨基酸位点，对该位点进行饱和突变充分发挥关键氨基酸位点的作用潜力，获得性质提升的突变体。而如何获取更多种性能优越的木聚糖酶突变体，以丰富糖苷水解酶家族的木聚糖酶种类，满足不同工业领域的需求，是亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种木聚糖酶突变体及其制备方法与应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过对第10家族木聚糖酶HwXyl10A关键氨基酸位点Gly363饱和突变后筛选得到的突变体，具体得到2种热稳定性和催化效率大幅度提高的木聚糖酶突变体，对于应用到饲料和利用生物质降解木聚糖产糖产业中具有广阔的前景。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种高比活耐热木聚糖酶突变体，包括以木聚糖酶HwXyl10A为母本对Gly363位点饱和突变后得到的一种或几种突变体。

优选的是，以木聚糖酶HwXyl10A为母本对Gly363位点饱和突变后得到2种高比活耐热木聚糖酶突变体HwXyl10A_G363R和HwXyl10A_G363K。

优选的是，所述HwXyl10A_G363R的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；

所述HwXyl10A_G363K的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。