[发明专利]利用牙髓间充质干细胞获得人工脊髓的用途及其制备方法

说明书

本发明公开了利用牙髓间充质干细胞获得人工脊髓的用途及其制备方法，该制备方法由以下步骤组成：步骤1：采集因正畸原因拔除的健康乳牙，用I型胶原酶消化并接种于培养瓶中，洗涤弃掉未贴壁细胞，将贴壁细胞重悬后进行培养获得牙髓间充质干细胞，步骤2：利用α‑MEM培养基对牙髓间充质干细胞培养使其增殖，步骤3：选取第三代牙髓间充质干细胞，当细胞融合率为90％时，利用含有维生素C的α‑MEM培养基对牙髓间充质干细胞培养得到白色膜状结构，并通过体外塑性，最终获得具备三维结构的人工脊髓；本发明获得的人工脊髓可抑制瘢痕形成和炎症以及促进轴突再生；在完全性脊髓损伤大鼠中，Spinor治疗引起了显着的运动改善，感觉恢复和更快的尿反射恢复。

技术领域

本发明属于人工脊髓的制备方法领域，尤其涉及利用牙髓间充质干细胞获得人工脊髓的用途及其制备方法。

背景技术

脊髓损伤(SCI)是一种复杂的病理生理学级联反应，特别涉及脊髓损伤导致的神经功能缺损，每年全世界的发病率超过千分之一。由于脊柱机械性损伤，全世界每年诊断出超过70万例新的SCI病例。在过去的十年里，外科技术的发展和普及导致SCI死亡人数下降了35％以上。但是，由于成人中枢神经系统神经元的先天再生能力差，手术无法逆转这种永久性残疾。即使存活，SCI幸存者，尤其是严重甚至完全SCI的患者，也要承受极端的身体折磨和对患者及其家庭的沉重精神负担。

为了摆脱这种困境，促进轴突生长和脊髓功能恢复，出现了两种通用策略：1)调节控制轴突再生的外在机制，如去除细胞外抑制分子，补充神经营养因子和嫁接容许基质；2)将干细胞移植到损伤部位以替换丢失或受损的神经元和少突胶质细胞，并操纵微环境以促进轴突再生。在过去的30年里，第一种策略在受损脊髓内的神经再生方面进展有限。至于第二种策略是干细胞移植治疗脊髓损伤，包括替换受损神经元，补充营养元素，抑制囊肿和瘢痕形成以及促进轴突延伸等多种治疗机制。在这种情况下，SCI恢复取得了一些成功，特别是在慢性SCI治疗方面取得了革命性的成功，然而在严重甚至完全的SCI中，损伤轴突的强劲再生和实质性的功能恢复仍然面临重大挑战。

实际上，只有少数移植的干细胞非常幸运地存活下来，并且其中有一小部分在受损的脊髓中分化成神经细胞。近年来，越来越多的证据表明干细胞的治疗效果和生物学活性归因于其细胞外分泌，包括但不限于趋化因子，细胞因子和细胞外微泡。其中，外泌体(exosome)是一类源于核内体的天然膜囊泡(50-150nm)，已被认为是影响治疗效果的最重要因素。干细胞来源的外泌体携带大量蛋白质、脂质和遗传物质，促进再生和抑制炎症。越来越多的证据表明，间充质干细胞(MSC)衍生的外泌体可以逆转多种退行性疾病，包括SCI、自闭症、中风、帕金森氏病、阿尔茨海默病等。然而，外泌体提取过程耗时耗力，因此，没有一种外泌体疗法被批准用于临床应用。

发明内容

本发明的目的是提供利用牙髓间充质干细胞获得人工脊髓的用途及其制备方法，以解决用于治疗脊髓损伤的外泌体提取过程耗时耗力的问题。

本发明采用以下技术方案：利用牙髓间充质干细胞获得人工脊髓的制备方法，由以下步骤组成：

步骤1：采集因正畸原因拔除的健康乳牙，用I型胶原酶消化并接种于培养瓶中，洗涤弃掉未贴壁细胞，将贴壁细胞重悬后进行培养获得牙髓间充质干细胞；

步骤2：利用α-MEM培养基对牙髓间充质干细胞培养使其增殖，

步骤3：选取第三代牙髓间充质干细胞，当细胞融合率为90％时，利用含有维生素C的α-MEM培养基对牙髓间充质干细胞培养得到白色膜状结构，并通过体外塑性，最终获得具备三维结构的人工脊髓。

进一步地，其中，步骤1和步骤2之间需对获得牙髓间充质干细胞进行细胞鉴定，其鉴定方法为：

将牙髓间充质干细胞与PE或FITC偶联的抗人CD73、CD146、CD105、CD11b、CD34或CD45的单克隆抗体孵育，

使用流式细胞仪对牙髓间充质干细胞进行表面标记的鉴定，