[发明专利]利用牙髓间充质干细胞获得人工脊髓的用途及其制备方法

权利要求书

1.利用牙髓间充质干细胞获得人工脊髓的制备方法，其特征在于，由以下步骤组成：

步骤1：采集因正畸原因拔除的健康乳牙，用I型胶原酶消化并接种于培养瓶中，洗涤弃掉未贴壁细胞，将贴壁细胞重悬后进行培养获得牙髓间充质干细胞，

步骤2：利用α-MEM培养基对牙髓间充质干细胞培养使其增殖，

步骤3：选取第三代牙髓间充质干细胞，当细胞融合率为90％时，利用含有维生素C的α-MEM培养基对牙髓间充质干细胞培养得到白色膜状结构，并通过体外塑性，最终获得具备三维结构的人工脊髓。

2.根据权利要求1所述的利用牙髓间充质干细胞获得人工脊髓的制备方法，其特征在于，其中，步骤1和步骤2之间需对获得牙髓间充质干细胞进行细胞鉴定，其鉴定方法为：

将牙髓间充质干细胞与PE或FITC偶联的抗人CD73、CD146、CD105、CD11b、CD34或CD45的单克隆抗体孵育，

使用流式细胞仪对牙髓间充质干细胞进行表面标记的鉴定，

利用成骨诱导培养基对牙髓间充质干细胞进行培养，

对牙髓间充质干细胞进行固定和染色，

利用成脂诱导培养基对牙髓间充质干细胞进行培育，

利用油红O溶液染色检测细胞内脂质积累，对其进行鉴定。

3.根据权利要求2所述的利用牙髓间充质干细胞获得人工脊髓的制备方法，其特征在于，其中，所述成骨诱导培养基的配方为：100nmol/L地塞米松、50mg/mL抗坏血酸和1mmol/Lβ-甘油磷酸盐。

4.根据权利要求3所述的利用牙髓间充质干细胞获得人工脊髓的制备方法，其特征在于，其中，所述成脂诱导培养基的配方为：0.5mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，0.5mmol/L氢化可的松，60mmol/L吲哚美辛和10μg/mL胰岛素。

5.根据权利要求1-4任一所述的利用牙髓间充质干细胞获得人工脊髓的制备方法，其特征在于，其中步骤3中的含有维生素C的α-MEM培养基中维生素C的含量为60-240μg/mL。

6.根据权利要求5所述的利用牙髓间充质干细胞获得人工脊髓的制备方法，其特征在于，其中步骤3中的含有维生素C的α-MEM培养基中维生素C的含量为120μg/mL。

7.一种应用于脊髓损伤治疗方法的产品，其特征在于：所述产品包括来源于牙髓间充质干细胞，而所述治疗方法包括：至少将所述牙髓间充质干细胞制备得到的人工脊髓移植到同种动物的脊髓损伤部位，形成连续脊髓。

8.牙髓间充质干细胞作为脊髓损伤动物模型治疗产品的用途，所述牙髓间充质干细胞来源于与动物模型同种的动物，所述用途包括：至少将所述牙髓间充质干细胞制备得到的人工脊髓移植到动物模型的脊髓损伤部位，形成连续脊髓。

9.根据权利要求8所述的牙髓间充质干细胞作为脊髓损伤动物模型治疗产品的用途，其特征在于，所述用途还包括：人工脊髓用于通过抑制瘢痕形成和炎症以及促进轴突再生形成连续脊髓。