[发明专利]一种生产羟基酪醇的重组大肠杆菌及其应用

说明书

本发明公开了一种生产羟基酪醇的重组大肠杆菌及其应用，属于生物技术领域。本发明采用E.coli YMGR5A作为宿主菌株，表达了大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中4‑羟苯基乙酸羟化酶基因HpaBC(GenBank登录号：CP053601.1)，即在宿主菌株基因组中，删除poxB基因并在该位点整合HpaBC基因，获得羟基酪醇高产菌株E.coli YMGRD1H1。采用本发明提供的重组大肠杆菌E.coli YMGRD1H1在葡萄糖的培养基中发酵生产羟基酪醇的产量可高达2.95g/L。

技术领域

本发明涉及一种生产羟基酪醇的重组大肠杆菌及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

羟基酪醇(hydroxytyrosol)是一种天然的多酚类化合物，主要来源于橄榄油中。众所周知，橄榄油被称为“液体黄金”。橄榄油是目前为止最易于人体健康的油类物质，具有多种营养价值。橄榄油中一种重要的作用物质，即为羟基酪醇。羟基酪醇由于具有多种生理和药理活性，使其应用范围广泛，如食品、药品、化妆品等领域。

目前已知的羟基酪醇作用就有多种：(1)心血管药物的合成：对动脉硬化、高血压、心脏病、脑溢血等预防与治疗；(2)安全高效的抗氧剂：应用于美容产品保健品；(3)抗衰老、对骨骼系统有益处：有助于人体对矿物质的吸收，减少骨骼疏松；(4)提高内分泌系统功能，促进新陈代谢，促进伤口愈合，消除体内自由基，恢复人体脏腑器官的健康状态，延缓衰老；(5)抗癌防癌：促进癌症后期恢复和提高化疗效果；(6)降低和抑制吸烟对人体的危害：防治因吸烟导致的多种病变。因此，大规模生产羟基酪醇成为必然的一种趋势。

目前我国对羟基酪醇的生产仍然处于天然提取和化学合成阶段；天然提取主要是从橄榄果、叶以及在橄榄油制备过程中产生的残渣和废水中进行的，其优点是原始材料便宜且丰富，但缺点是使用强酸性水蒸汽，回收率低，且易产生二次污染；而化学合成的缺点就更为明显，使用基质相对昂贵，并且这些过程通常需要保护和脱保护步骤，降低总收率；成本高、污染严重、安全性低，不能应用于食品及药品的添加。

目前，在现有报道当中，虽然有采用安全高效的生物法合成羟基酪醇，例如：通过表达埃及糖精的Sam5进行生产羟基酪醇(记载于Production of three phenylethanoids,tyrosol,hydroxytyrosol,and salidroside,using plant genes expressing inEscherichia coli论文中)，但是其转化效率不如采用羟化酶基因HpaBC；而现有技术中，诸如粘质沙雷氏菌，铜绿假单胞菌，恶臭假单胞菌F6和盐单胞菌等含有的羟化酶具有同样的功能，如何选择合适的羟化酶基因HpaBC以高效的制备羟基酪醇，成为研究的热点。

发明内容

技术问题

本发明所要解决的技术问题是：提供一种安全高效、价格低廉并且不需要用诱导剂、抗生素的生物法合成羟基酪醇的方法。

技术方案

在现有技术的基础上，本发明提供了一种生物合成羟基酪醇的方法。利用现代生物基因工程的技术，在已有酪醇高产菌株的基础上构建了一株高产羟基酪醇的方法(代谢途径的改造方法如图4所示)，且发酵不需要诱导剂和抗生素。

为了解决上述问题，本发明提供了一种重组大肠杆菌，以大肠杆菌CCTCC NO：M2019390为宿主细胞，并且表达了来源于大肠杆菌的羟化酶基因HpaBC。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌CCTCC NO：M2019390记载于公开号为CN110452865A的中国专利申请文本中，命名为E.coli YMGR5A。

在本发明的一种实施方式中，所述羟化酶HpaBC包括羟化酶HpaB和羟化酶HpaC，其中，羟化酶HpaB的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示，羟化酶HpaC的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。