[发明专利]一种生产羟基酪醇的重组大肠杆菌及其应用

权利要求书

1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌CCTCC NO：M2019390为宿主细胞，敲除了宿主基因组上的poxB基因，并在poxB基因位点整合了来源于大肠杆菌的羟化酶基因HpaBC；所述羟化酶HpaBC包括羟化酶HpaB和羟化酶HpaC，其中，羟化酶HpaB的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示，羟化酶HpaC的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。

2.如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述羟化酶HpaBC的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。

3.构建权利要求1或2所述的重组大肠杆菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将HpaBC基因插入到质粒pEtac中，获得重组质粒pEtac-HpaBC，以大肠杆菌E.coliMG1655基因组以及质粒pEtac-HpaBC为模板分别扩增，得到片段poxBUP、poxBDown、tac-HpaBC-T7 terminater；

(2)将片段poxBUP、poxBDown、tac-HpaBC-T7 terminater连接，获得poxB∷HpaBC删除表达盒；

(3)采用CRISPR-cas9的方法，先将pCas质粒采用电转化的方法转化进入大肠杆菌CCTCC NO：M2019390感受态细胞中，然后将带有sgRNA的质粒sg-pTarget及poxB∷HpaBC的删除表达盒电转化进入大肠杆菌CCTCC NO：M2019390感受态细胞中；挑取转化成功的转化子，利用IPTG进行诱导，消除sg-pTarget质粒，构建得到重组大肠杆菌。

4.一种生产羟基酪醇的方法，其特征在于，采用权利要求1或2所述的重组大肠杆菌发酵生产羟基酪醇。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法为，将所述重组大肠杆菌接种至种子培养基中培养，制备得到种子液；将种子液接种至发酵培养基中，发酵制备羟基酪醇。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，将所述重组大肠杆菌接种至LB固体培养基上培养，得到单菌落，挑取单菌落接种于LB液体培养基中，于35～39℃、180-220r/min条件下培养10～14h，制备得到种子液。

7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，将制备得到的种子液接种至LB液体培养基中，在35～40℃、180-220r/min条件下培养10～14h后收集菌体；将收集得到的菌体接种至M9Y液体培养基中进行发酵培养，制备得到羟基酪醇。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述种子液的接种量为1％。

9.权利要求1或2所述的重组大肠杆菌在制备羟基酪醇及含有羟基酪醇的产品中的应用。