[发明专利]一种提高酿酒酵母2-苯乙醇产量的方法

说明书

一种提高酿酒酵母2‑苯乙醇产量的方法，属于生物技术领域。本申请一方面提供了一种CRISPR/Cas9基因编辑系统，另一方面提供了利用该CRISPR/Cas9基因编辑系统提高酿酒酵母2‑苯乙醇产量的方法。本申请能够对产2‑PE的酿酒酵母乙酰基转移酶（ATF1基因）催化的分支途径进行敲除，抑制2‑PE进一步转化为苯乙酰乙酯，提高了2‑PE产量，又降低了副产物进而提高后续分离2‑PE的纯度，降低了生产成本。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高酿酒酵母2-苯乙醇产量的方法。

背景技术

2-苯乙醇（2-PE）是一种具有玫瑰花香味的芳香剂醇，存在很多植物以及玫瑰花的植物精油中，其它含有天然2-苯乙醇的产品是一些涉及发酵的食品，像酒类和奶酪等。2-PE由于其含有独特的香味而倍受到人们的追捧，得到了广泛的应用，例如作为食品、药品、烟草、日化用品、化妆品等的添加剂。2-PE还可以用作生产其衍生物的底物，如另一种有价值的风味化合物苯乙酸乙酯。

目前在工业上生产2-PE的方法以天然法和化学合成法为主。其中化学合成法不仅底物有毒，且产物中总会含有难以去除的副产品，因此很难受到广泛的应用，食品行业尤为突出，致使人们更加倾向于使用天然的香精化合物。天然法生产2-PE分为从植物或天然基质中直接提取法以及微生物转化法，前者由于原料供应不足以及提取步骤繁琐且效率低，无法满足工业生产，因此天然2-PE的生产主要聚焦在了微生物转化上。

在目前已知可以产生2-PE的微生物中，主要包括酵母、真菌、大肠杆菌等。酿酒酵母作为一种国际公认的安全模式微生物，并且由于其容量、坚韧性、生物安全性高且利于操作，因此作为2-PE生产研究最广泛的菌种。

基因工程是目前研究代谢途径的主要工具之一，其中CRISPR/CAS9基因编辑技术近些年来快速发展，与传统的基因工程技术相比，具有编辑效率高，周期短，操作简单以及能够同时对多个基因进行编辑等优点，已经应用于微生物代谢工程改造，在酿酒酵母中受到广泛的应用。

酿酒酵母中产2-PE的代谢途径包括两条，一是由葡萄糖开始的莽草酸从头合成途径，二是由L-苯丙氨酸（L-Phe）经过生物转化生成2-PE的艾氏途径，前者产量很低，主要以艾氏途径作为主。在艾氏途径中， L-苯丙氨酸在转氨酶的作用下转化为苯丙酮酸，再由苯丙酮酸脱羧酶催化脱去了一个羧基形成苯乙醛，苯乙醛在乙醇脱氢酶的作用下产生2-PE。

2-PE的合成的艾氏途径中存在两条分支途径，一是苯乙醛可以在乙醛脱氢酶的作用下氧化为苯乙酸，二是产物2-PE可以在乙酰基转移酶的作用下进一步转化为2-苯乙酰乙酯。因此，利用代谢工程原理和基因工程技术，切断分支途径是减少物质和能量分流，提高目标产物2-PE的菌株改造策略。乙醛脱氢酶产生的分支途径的切断已经有研究报道，Kim等人通过在酿酒酵母W303敲除ALD3、ALD2，以83mg/L L-Phe作为底物，最终2-PE产量较出发菌株提高了约35%[ Kim, B., B.R. Cho, and J.S. Hahn, Metabolic engineering ofSaccharomyces cerevisiae for the production of 2-phenylethanol via Ehrlichpathway. Biotechnol Bioeng, 2014. 111(1): p. 115-24.]。

但是，乙酰基转移酶催化的分支途径尚未有相关报道。2-PE的合成后可以在乙酰基转移酶的作用下进一步转化为2-苯乙酰乙酯，降低了2-PE产量，同时增加了副产物。因此，如果抑制苯乙酰乙酯的产生既可以提高2-PE积累又降低了副产物，一举两得。酿酒酵母乙酰基转移酶主要由ATF1基因编码，本申请就是利用基因编辑技术对产2-PE的产生菌酿酒酵母的ATF1基因进行敲除，从而达到上述目的。

发明内容