[发明专利]一种动态准确检测原代肿瘤细胞免疫特征的方法

权利要求书

1.一种原代肿瘤细胞免疫特征的检测方法，包括原代膀胱癌细胞免疫相关蛋白PD-L1表达情况及对细胞因子IFN-γ响应情况的检测，原代细胞对PD-1蛋白结合能力的测定，以及数据的统计分析；其特征在于，具体步骤为：

（1）原代肿瘤细胞按一定密度铺板；

（2）对细胞进行IFN-γ刺激处理；

将培养过夜的原代肿瘤细胞进行换液，对照组的上清更换为新鲜的Complete F培养基，处理组的上清更换为含有IFN-γ的Complete F培养基，置于37℃，5%CO₂条件下培养24h；

（3）采用高通量流式细胞仪对样品进行检测，包括：

（3.1）对照组的原代肿瘤细胞检测其表面固有PD-L1表达水平；

（3.2）处理组的原代肿瘤细胞检测IFN-γ刺激后细胞表面诱导性PD-L1表达水平；

（3.3）对照组的原代肿瘤细胞同时检测细胞对人PD-1-Fc嵌合蛋白的结合能力：将原代肿瘤细胞依次同人PD-1-Fc嵌合蛋白和Anti-IgG抗体进行孵育，随后采用高通量流式细胞仪检测其对人PD-1-Fc嵌合的结合能力；

（4）对流式细胞仪检测数据进行统计学分析，包括标准化处理流式检测数据。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述原代肿瘤细胞来自从膀胱癌患者的肿瘤组织或尿液中分离得到的肿瘤上皮细胞经体外培养后获得。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述原代肿瘤细胞为条件性重编程培养法培养的原代肿瘤细胞，所述条件性重编程培养法选用Complete F培养基进行培养。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述IFN-γ的含量为50 IU/mL~300IU/mL。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（3）分为两部分：原代细胞表面PD-L1表达水平检测采用Anti-PD-L1检测抗体进行孵育，原代细胞对PD-1蛋白的结合能力检测采用两步孵育法，分别依次同人PD-1-Fc嵌合蛋白和Anti-IgG检测抗体孵育。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述Anti-PD-L1检测抗体稀释比例为1:2000 ~ 1:5000；所述Anti-IgG检测抗体稀释比例为1:100～1:500。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述原代细胞表面PD-L1表达水平检测，具体流程是：IFN-γ刺激24h后，收集细胞，用PBS清洗两遍后，对照组和处理组均加入稀释好的PD-L1检测抗体，4℃避光孵育30 min，再次PBS清洗后进行荧光强度检测。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述原代细胞对人PD-1-Fc嵌合蛋白的结合能力检测，具体流程是：对照组细胞用PBS清洗两遍后分为两等份，一份中加入纯化的hPD-1-Fc蛋白室温孵育30 min，一份作为不孵育的对照，孵育完成后采用PBS清洗两遍，去除掉未结合的蛋白，之后两份均加入稀释好的Anti-IgG抗体4℃避光孵育30 min，再次PBS清洗后进行荧光强度检测。

9. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（4）中所述标准化处理流式检测数据，是采用高通量流式细胞技术检测原代肿瘤细胞的免疫特征，批次之间采用不表达人PD-L1的中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1 和过表达人PD-L1的CHO-K1-PD-L1稳转细胞株作为标准化对照。

10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，对不同患者来源的原代肿瘤细胞经高通量流式细胞仪检测其PD-L1蛋白表达水平及PD-1蛋白结合能力，并通过临床回顾性分析，将原代肿瘤细胞免疫特征与对应患者免疫治疗的响应情况进行对比分析，从而对患者临床免疫治疗的效果进行预测。