[发明专利]一种用于检测副溶血性弧菌DNA的反应体系、试剂盒及其应用

说明书

本发明属于病原诊断技术领域，具体涉及一种用于检测副溶血性弧菌DNA的反应体系、试剂盒及其应用。本发明利用SHERLOCK技术建立了一种快速检测致病性副溶血性弧菌的检测方法，该方法可检测副溶血性弧菌的tlh基因、tdh基因、trh基因和toxR基因四种致病基因，特异性强，灵敏度高，并且操作简便快捷，结果读取准确迅速，克服了现有检测方法检测时间过长且灵敏度不够高的问题。

技术领域

本发明属于病原诊断技术领域，具体涉及一种用于检测副溶血性弧菌DNA的反应体系、试剂盒及其应用。

背景技术

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）是一种广泛存在于海洋和盐湖中的嗜盐致病菌，致病力强，临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状，患者病后免疫力不强，可重复感染，严重者可发生休克。流行病学调查显示，由副溶血性弧菌感染引起的食物中毒在世界范围内引起了多次食源性公共卫生事件，对人类健康状况构成了威胁。研究发现，溶血毒素是引起副溶血性弧菌致病性的主要因素，其中溶血毒素包括耐热直接溶血素（TDH）、耐热直接溶血素相关溶血素（TRH）和不耐热溶血素（TLH）。副溶血性弧菌的主要毒力因子有TLH、TDH和TRH。TLH是一种非典型的磷脂酶，能溶解人的红细胞，具有副溶血性弧菌种属的特异性。TDH能在我妻氏血平板上引起β－溶血(神奈川现象)，具有致死毒性、心脏毒性、细胞毒性和肠毒素作用。TRH虽不能引起神奈川现象，但其与TDH有相似的免疫原性和 67% 的相同氨基酸序列，并同样具有致死作用和细胞毒性。而 toxR基因是近年来在副溶血性弧菌中新发现的致病基因，与副溶血性弧菌的毒力和致病性密切相关。

现有副溶血性弧菌检测方法主要有PCR检测法、Elisa检测法、免疫胶体金 (ICG)检测法、核酸序列恒温扩增(NASBA)检测法等。在实际样品检测工作中，现有的检测技术主要存在的问题一是灵敏度不够高，无法检测到潜伏感病样品；二是容易产生假阳性，对模板质量要求高；三是操作繁琐，对实验条件要求高，不利于一线技术人员操作。

SHERLOCK是一种新型的等温核酸检测技术，即利用Crispr-Cas13a反应系统，将Cas13a的附带切割作用与等温扩增相结合，以建立基于CRISPR的诊断平台（CRISPR-Dx），可实现具有渺摩尔（aM）灵敏度和单碱基错配特异性的快速DNA或RNA检测。SHERLOCK反应可在5~60min之内实现致病菌的检测，在37~42 ℃即可进行快速、高灵敏度的检测，摆脱了恒温扩增设备的束缚。整个反应过程使用荧光读取器进行荧光值的读取，具有安全、快捷、高效的特点，此外，SHERLOCK反应试剂可冻干，具有冷链独立性和长期保存、易于推广等特点。目前尚未出现SHERLOCK技术应用在副溶血性弧菌检测的相关研究报道。

发明内容

为了克服现有技术中所存在的缺陷，本发明提供一种用于检测副溶血性弧菌核酸的反应体系、试剂盒及其应用。利用SHERLOCK技术建立了一种快速检测致病性副溶血性弧菌的检测方法，该方法可检测副溶血性弧菌的四种致病基因，特异性强，灵敏度高，并且操作简便快捷，结果读取准确迅速，克服了现有检测方法检测时间过长且灵敏度不够高的问题，适用于食品、水样、粪便、呕吐物、增菌液等多样本中副溶血性弧菌的定性检测。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个方面是提供一种用于检测副溶血性弧菌核酸的反应体系，该反应体系为SHERLOCK反应体系，其包括用于扩增目的核酸片段的引物组和/或对应的crRNA；所述目的核酸片段包括tlh基因、tdh基因、toxR基因和/或trh基因中的一种或多种。

其中，所述tlh基因的引物对如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，所述tlh基因的crRNA如SEQ ID NO：3所示；

所述tdh基因的引物对如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示，所述tdh基因的crRNA如SEQ ID NO：6所示；