[发明专利]一种基于非荧光标记探针的高分辨熔解曲线的基因突变检测试剂盒、检测方法及其应用

说明书

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种基于非荧光标记探针的高分辨熔解曲线的基因突变检测试剂盒、检测方法及其应用，所述试剂盒包括由一条非荧光标记探针、两条正反向扩增引物、5’‑3’外切酶活性缺失的DNA聚合酶、荧光染料、dNTP混合液以及PCR缓冲液所组成的系统；其中：所述非荧光标记探针为3’末端经过基团修饰封闭从而失去延伸能力的非荧光标记探针。本发明的检测系统将普通的寡核苷酸替代昂贵的荧光探针进行核酸识别并达到基因多态性的检测目的，利用非荧光标记探针和存在突变位点的靶序列结合，通过熔解曲线分析，将不同熔解温度的序列转化为信号的生成，通过非荧光标记探针实现对基因突变的快速检测。

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种基于非荧光标记探针的高分辨熔解曲线的基因突变检测试剂盒、检测方法及其应用。

背景技术

基因突变的研究已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应(polymerase chainreaction PCR)技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性(single-strandcomformational polymorphism SSCP)和异源双链分析法(heteroduplex analysis HA)。

目前对基因突变的检测都离不开PCR技术。简单的说，PCR就是利用DNA聚合酶对特定基因做体外的大量合成，通过DNA聚合酶特异性的复制，可以将一段基因放大为原来的一百亿至一千亿倍，从而易于进一步的分析。PCR反应必须具备的条件为：复制的DNA模板、特异的一对引物、DNA聚合酶、合成的原料及反应需要的缓冲体系。PCR由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因复制到成百上千亿倍。