[发明专利]一种高立体选择性的甲硫氨酸腺苷转移酶及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种高立体选择性的甲硫氨酸腺苷转移酶及其制备方法与应用，通过提取星海链霉菌的基因组；以基因组为DNA模板，采用PCR扩增技术，得到星海链霉菌中的甲硫氨酸腺苷转移酶的基因序列即metK目的片段；将metK目的片段与表达载体pET‑32a(+)进行双酶切后连接，构建重组质粒；采用热激化法将重组质粒转化到大肠杆菌BL21的感受态细胞中，并经过异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷诱导表达，得到SxMAT；通过对高立体选择性的甲硫氨酸腺苷转移酶进行变性后复性的方式，得到高纯度的SxMAT，所述SxMAT在温度为25‑55℃，pH值为8‑10.5时稳定性好，且产物的光学纯度(ee)90％，产率为80％，SxMAT与氟化酶联用构建体外双酶级联反应，有益于人们对链霉菌中氟化通路的理解以及衍生对氟化天然产物的应用。

技术领域

本发明属于蛋白质与酶工程技术领域，具体涉及一种高立体选择性的甲硫氨酸腺苷转移酶及其制备方法与应用。

背景技术

S-腺苷-L-甲硫氨酸，即S-腺苷甲硫氨酸，常用缩写方式包括SAM、SAM-e和AdoMet。在生物体内，S-腺苷甲硫氨酸是以L-甲硫氨酸(L-Met)和三磷酸腺苷(ATP)为底物，在甲硫氨酸腺苷转移酶也叫S-腺苷-L-甲硫氨酸合成酶(MAT,EC 2.5.1.6)的催化下形成的。在此反应中，首先生成S-腺苷-L-甲硫氨酸和三聚磷酸盐；随后，得到的三聚磷酸盐被不对称水解，产生焦磷酸盐(ppi)和正磷酸盐(pi)。S-腺苷-L-甲硫氨酸广泛存在于动物、植物和微生物体内，参与生物体内40多种生化反应，是生物体内重要的生理活性物质。S-腺苷-L-甲硫氨酸作为一种重要代谢中间化合物，通过转甲基、转硫基和转氨丙基等反应参与人体众多代谢途径，是保证人体正常生命活动所不可或缺的重要物质。临床研究表明，S-腺苷-L-甲硫氨酸对肝脏疾病、抑郁症、关节炎等许多疾病具有治疗效果，同时，S-腺苷-L-甲硫氨酸是细胞内原有的代谢物，具有易吸收、副作用小等特点。1999年，美国FDA批准S-腺苷-L-甲硫氨酸以SAM-e为名字，作为膳食补充剂在美国上市。近年来，国内外尝试用S-腺苷-L-甲硫氨酸对肝脏疾病、抑郁症等进行治疗，并获得一定成效，使其市场需求不断扩大。

S-腺苷-L-甲硫氨酸的制备始于上世纪50年代，主要有化学合成法，微生物发酵法和酶催化法三种。相比于化学合成法和微生物发酵法，酶催化法因具有立体选择性高、反应条件温和、反应时间短、产物易分离、对环境友好等特点，成为近年来研究S-腺苷-L-甲硫氨酸制备的热点方向。迄今为止，已经从不同来源的细菌中分离并鉴定出甲硫氨酸腺苷转移酶，如毕赤酵母、甲烷球菌、枯草芽孢杆菌、嗜热厌氧菌、大肠杆菌等。甲硫氨酸腺苷转移酶虽然广泛存在于动物、植物和微生物，但天然表达的甲硫氨酸腺苷转移酶含量少，分离纯化困难，因而限制了酶催化法的大规模使用。因此，构建高效表达甲硫氨酸腺苷转移酶工程菌成为用酶催化法制备S-腺苷-L-甲硫氨酸的首要任务。与此同时，S-腺苷-L-甲硫氨酸是一种含有两个手性中心的化合物，具有(R,S)-SAM和(S,S)-SAM两种异构体，但仅有(S,S)-SAM具有生物活性。尽管如此，并没有报道能够通过酶催化法获得较纯的产物(S,S)-SAM的方法。

氟化天然产物因其具有独特的物理和化学性质而受到生物学家和化学家的持续关注。氟化酶(FLA)作为一种已发现的酶，其能够将无机氟离子(F^-)催化到有机分子中形成碳-氟(C-F)键，生成有机氟化物。在2002年，英国David O’Hagan教授的研究小组从卡特利亚链霉菌(Streptomyces cattleya)中分离出第一个天然氟化酶(由flA基因编码)。它能够利用无机氟离子和S-腺苷-L-甲硫氨酸催化S_N2生物亲核反应，生成5’-氟化脱氧腺苷(5’-FDA)和L-甲硫氨酸。随着对氟化酶及其代谢通路的研究，从2014年到2016年，在不同菌种中确定了四个新的氟化酶。其中，在星海链霉菌(Streptomyces xinghaiensis)中发现的氟化酶具有最优的酶学性质。因此以甲硫氨酸腺苷转移酶化生成的产物S-腺苷-L-甲硫氨酸作为氟化酶催化的反应底物，构建一个双酶级联反应，更有益于人们对链霉菌中氟化通路的理解以及衍生对氟化天然产物的应用。

发明内容