[发明专利]一种基于膜培养的酵母型真菌快速分析方法

说明书

本发明公开了一种基于膜培养的酵母型真菌快速分析方法，包括以下步骤，S1、实验材料（1）白色念珠菌标准株、热带念珠菌标准株、克柔念珠菌标准株、光滑念珠菌标准株、30株白色念珠菌临床分离株、21株热带念珠菌临床分离株、15株克柔念珠菌临床分离株和12株光滑念珠菌临床分离株；S2、菌株培养，根据实验目的不同，实验中所有菌株采用沙保罗固体培养基（实验室配制）30℃培养，或酵母膏‑蛋白胨‑葡萄糖（YPD）培养液（实验室配制）中30℃，220rpm振荡培养。该基于膜培养的酵母型真菌快速分析方法，既能保留培养法的优势以对真菌样本达到增菌富集处理，又能与高灵敏度qPCR衔接，因此只需获取qPCR检测足够用的菌量即可，无需长时间培养。

技术领域

本发明涉及真菌分析研究技术领域，具体为一种基于膜培养的酵母型真菌快速分析方法。

背景技术

真菌感染主要针对免疫力低下的人群，老龄化社会的到来，艾滋病、糖尿病、恶性肿瘤、血液病、自身免疫性疾病的频发加之各种药物的广泛应用，真菌感染率、真菌病发病率和致死率呈逐年上升趋势，在我国，真菌感染占各种病原菌感染总数的10～20%，在美国，真菌感染的发生率在20年间上升了3倍，真菌感染的病原体以念珠菌居多，且引起血液系统感染、真菌性脑膜炎等深部感染所导致的死亡率最高，临床上常见的念珠菌病原体包括白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌和克柔念珠菌等，其中白色念珠菌所占比例最大，真菌与细菌结构不同，在抗真菌治疗时的药物选择需要慎重。

目前已有真菌感染诊断方法总体呈现“方法少、检测慢、精度低”的特点，培养法较为费时且检测灵敏度也受到样本中菌量的影响；β-D-葡聚糖免疫学检测种属特异性较差，此外，克柔念珠菌和光滑念珠菌对主要抗真菌药物氟康唑和伊曲康唑均具有天然耐药性，因此，研究开发出快速、准确的真菌鉴定方法非常必要。

针对上述问题，急需通过基于膜培养的酵母型真菌快速分析方法，对真菌进行分析研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于膜培养的酵母型真菌快速分析方法，以解决上述背景技术中提出的培养法较为费时、β-D-葡聚糖免疫学检测种属特异性较差，此外，克柔念珠菌和光滑念珠菌对主要抗真菌药物氟康唑和伊曲康唑均具有天然耐药性，不利于快速准确对真菌进行鉴定分析的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于膜培养的酵母型真菌快速分析方法，包括以下步骤：

S1、实验材料

（1）白色念珠菌标准株、热带念珠菌标准株、克柔念珠菌标准株、光滑念珠菌标准株、30株白色念珠菌临床分离株、21株热带念珠菌临床分离株、15株克柔念珠菌临床分离株和12株光滑念珠菌临床分离株。

（2）本实验使用的所有临床分离株均已采用念珠菌显色培养基鉴定种属。

S2、菌株培养

根据实验目的不同，实验中所有菌株采用沙保罗固体培养基（实验室配制）30℃培养，或酵母膏胨葡萄糖（YPD）培养液（实验室配制）中30℃，220rpm振荡培养。

S3、念珠菌引物选择

从白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌和克柔念珠菌的核糖体DNA基因编码区域，即18SrRNA、转录间隔区-1、5.8SrRNA、转录间隔区-2和28SrRNA五个区段选择不同水平的检测引物，即真菌通用引物ITS84/ITS6、念珠菌通用引物pCps-1F/1R、白色念珠菌特异引物Caps-1F/1R、热带念珠菌特异引物CTR1/2、光滑念珠菌特异引物CGL1/2和克柔念珠菌特异引物CKRU1/2。

S4、膜培养

（1）膜培养技术所使用的培养基包括表面铺有白色微孔滤膜的沙保罗平板和没有营养成分的显色平板两部分，纤维素微孔滤膜允许水分和养分交换，但阻隔了念珠菌细胞通过，显色平板由含有0.8mg/ml噻唑蓝的1%琼脂糖凝胶制成。