[发明专利]一种基于膜培养的酵母型真菌快速分析方法

权利要求书

1.一种基于膜培养的酵母型真菌快速分析方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、实验材料

(1)白色念珠菌标准株、热带念珠菌标准株、克柔念珠菌标准株、光滑念珠菌标准株、30株白色念珠菌临床分离株、21株热带念珠菌临床分离株、15株克柔念珠菌临床分离株和12株光滑念珠菌临床分离株。

(2)本实验使用的所有临床分离株均已采用临床念珠菌培养专用CHROMagar(科玛嘉)显色培养基鉴定种属。

S2、菌株培养

根据实验目的不同，实验中所有菌株采用沙保罗固体培养基(实验室配制)30℃培养，或酵母膏胨葡萄糖(YPD)培养液(实验室配制)中30℃，220rpm振荡培养。

S3、念珠菌引物选择

从白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌和克柔念珠菌的核糖体DNA基因编码区域，即18SrRNA、转录间隔区-1、5.8SrRNA、转录间隔区-2和28SrRNA五个区段选择不同水平的检测引物，即真菌通用引物ITS84/ITS6、念珠菌通用引物pCps-1F/1R、白色念珠菌特异引物Caps-1F/1R、热带念珠菌特异引物CTR1/2、光滑念珠菌特异引物CGL1/2和克柔念珠菌特异引物CKRU1/2。

S4、膜培养

(1)膜培养技术所使用的培养基包括表面铺有无菌白色纤维素微孔滤膜的沙保罗平板和没有营养成分的显色平板两部分，纤维素微孔滤膜允许水分和养分交换，但阻隔了念珠菌细胞通过；此外，在微孔滤膜上附着有2mm厚度的沙保罗固体培养基薄层。显色平板由含有0.5～1.0mg/ml噻唑蓝的1％琼脂糖凝胶制成。与膜培养实验平行设置有使用沙保罗平板的常规培养实验组。

(2)无菌条件下挑取一个白色念珠菌菌落用YPD培养液1:1000稀释，分别取10μl稀释菌液涂布接种膜平板，30℃培养，分别在2h、4h、6h、8h、12h和24h取出滤膜，将滤膜转移到显色平板上，同时观察滤膜上菌落的显色情况和常规培养的菌落生长状况，每个时间点设置三个平行。

S5、菌落PCR

(1)挑取上述经膜培养且已显色指示的细小念珠菌菌落，重悬于20μl念珠菌裂解液中，进行涡旋振荡，短暂涡旋振荡后，于98℃孵育5min，1500xg离心10min，收集上清液，用无菌超纯水按照1:5～1:20进行稀释后，分别作为模板，进行PCR测试。

(2)选择白色念珠菌特异引物Casps-1F/1R，退火温度58℃，以无菌超纯水为模板作为空白对照，2％琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果。

S6、念珠菌基因组DNA提取

分别取各念珠菌新鲜菌液1ml于1.5ml无菌离心管中，13400×g离心1min，弃上清液，利用酵母基因组DNA提取试剂盒对上述念珠菌菌体进行破壁、柱结合、漂洗、洗脱等处理，最终得到基因组样本，紫外分光光度计定量，-30℃冻存备用。

S7、各引物特异性和检测限的常规PCR分析

(1)分别以1ng四种念珠菌基因组DNA、常见细菌基因组DNA和人基因组DNA为模板，按步骤S5的PCR参数设置，对所选择的6对引物特异性进行测试，以无菌超纯水为模板作为空白对照。

(2)扩增结果经琼脂糖凝胶电泳分析，分别将1ng的四种念珠菌基因组DNA进行10～10⁶倍稀释，对6对引物的常规PCR检测限进行测试，以无菌超纯水为模板作为空白对照，扩增结果经琼脂糖凝胶电泳分析。

S8、各引物特异性和检测限的qPCR检测及熔解曲线分析

(1)采用iQ5 qPCR仪对步骤S7中各引物特异性和检测限进行qPCR分析，利用SYBRGreenPremix ExTaq试剂盒分别配制25μl体系。

(2)qPCR程序设置为95℃预变性30s，“95℃，5s→58℃，5s→72℃，5s”重复35个循环。

(3)随后进行熔解曲线分析：以0.1℃/s的速度将温度从60℃升至95℃，记录每个qPCR扩增子的荧光强度变化，生成熔解曲线，每个qPCR阈值由iQ5软件系统默认设置决定，以无菌超纯水为模板作为空白对照，设置一组平行。

S9、临床分离株qPCR验证

对78株念珠菌临床分离株进行qPCR检测和熔解曲线分析，每种念珠菌分别通过真菌通用引物、念珠菌属通用引物和念珠菌种特异引物进行多个靶点的扩增。

S10、数据分析

采用iQ5分析软件和微软Excel工具对qPCR数据进行平均值标准偏差分析。

S11、结果

(1)膜培养结果

相比常规培养24h可见菌落生长，膜培养能将念珠菌菌落肉眼可见时间提前至8～12h，相比常规培养方法，可缩短培养时间50％以上，如图1-4所示，培养8h的滤膜经显色后肉眼可见蓝紫色菌落斑点。采用膜显色培养8h后即可进行菌落计数，且其计数结果与培养12h后的菌落计数结果相符，同时，该计数结果也与传统沙氏葡萄糖琼脂培养的计数结果相符。但前者的菌落可肉眼计数的时间显著提前。

(2)菌落PCR结果

结果表明，菌落经噻唑蓝着色后未影响PCR进行，除了1:5菌落裂解液PCR为阴性之外，其余三个稀释度的模板均扩增出单一条带，且产物大小与预期272bp的结果相符，PCR阴性可能因为裂解液浓度过高，显示结果如图5所示：

泳道M：DNAmarker；

泳道1：菌落裂解液1:5稀释；

泳道2：菌落裂解液1:10稀释；

泳道3：菌落裂解液1:15稀释；

泳道4：菌落裂解液1:20稀释；

泳道5：空白对照。

(3)常规PCR和qPCR的检测限与特异性对比

1、与常规PCR中各引物的检测限为1pg～100pg相比，qPCR中各引物的检测限为1fg～100fg，总体比常规PCR的灵敏度高出1000倍，如图6-11所示(qPCR熔解曲线图示的横坐标为温度(℃)，纵坐标为熔融峰)，被扩增基因每个温度下的相对荧光单位数据的负导数(-dRFU/dT)，随着模板量减少，熔融峰呈下落趋势，检测限即为能获得熔融峰的最小模板DNA量。

2、各引物特异性经常规PCR扩增产物电泳分析后，条带特异单一，但琼脂糖电泳的分辨率不高，对于大小接近的条带无法进一步鉴别，而qPCR结合熔解曲线分析结果显示，每种念珠菌经三个靶点qPCR鉴定后，形成独特的熔融峰组合图谱，四种念珠菌的三重熔解温度按照真菌通用-念珠菌通用-念珠菌特异的引物顺序分别为白色86.5℃-85.5℃-85.5℃、热带74.5℃-85℃-84℃、光滑74.5℃-84.5℃-75℃、克柔75℃-86.5℃-90℃，结果如图12-15所示(图中A-D分别为白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌和克柔念珠菌三重熔融峰)。

(4)念珠菌临床分离株qPCR分析

如图16-18所示，各引物对同种念珠菌的qPCR熔解温度呈现稳定的趋势，表中N值代表临床分离株数，78株分离株中有两株“光滑”念珠菌与四种念珠菌熔解温度均不匹配，故收集的经显色培养基鉴定的12株光滑念珠菌中只确认10株，故与显色培养基鉴定结果相比，除了光滑念珠菌符合率为83.33％以外，其余三种念珠菌均为100％。两株疑似的“光滑”念珠菌后经DNA测序鉴定为近平滑念珠菌。