[发明专利]一种提高钝齿棒杆菌厌氧发酵产L-精氨酸的方法

说明书

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种提高钝齿棒杆菌厌氧发酵产L‑精氨酸的方法。本发明成功实现了敲除硝酸盐呼吸narKGHJI操纵子的抑制转录调控因子arnR基因，在钝齿棒杆菌中过量表达大肠杆菌的亚硝酸还原酶基因nirBD。优化NaNO₃添加量，最终重组钝齿棒杆菌ΔarnR/pXMJ19‑nirBD摇瓶厌氧发酵至120h，重组菌的L‑精氨酸产量达到2.41±0.11g/L，较出发菌株提高了28.8％，实现了提高厌氧发酵L‑精氨酸的产量。说明敲除arnR基因和过量表达大肠杆菌的亚硝酸还原酶基因nirBD对厌氧发酵L‑精氨酸的产量具有显著效果。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种提高钝齿棒杆菌厌氧发酵产L-精氨酸的方法。

背景技术

对于氨基酸的生产，在发酵过程中保持溶解氧在一定水平是至关重要的。为此，一般的解决方案是增加发酵过程中的曝气和搅拌速度。然而，通过注入无菌纯氧、空气，或者提高搅拌速度获得的高氧供应，能耗高，增加成本。此外，过量的注入氧气或空气会使菌体的产生活性氧而损害自身，并且增加染杂菌和噬菌体的风险。因此，通过改造钝齿棒杆菌厌氧发酵产L-精氨酸具有重要的实际意义。

在没有氧气的环境中生长的专性厌氧菌和兼性厌氧菌，具有各种厌氧代谢途径，总体分为两种：“厌氧呼吸”和“发酵”。在典型的“发酵”中，没有任何电子受体，大部分碳通量都指向乙醇、乳酸和琥珀酸盐。因此，在发酵代谢的同时，很难实现氨基酸的高效生产。此外，许多微生物可以利用氧以外的各种化合物作为终端电子受体来实现厌氧呼吸。例如，许多细菌拥有硝酸盐呼吸系统，使用硝酸盐作为电子受体。硝酸盐呼吸系统与发酵代谢不同，不会增加有机酸产生。因此，碳通量可以有效地指向氨基酸生物合成。钝齿棒杆菌也可以以硝酸盐为末端电子受体，在无氧气限制下生长。由于缺少亚硝酸还原酶，钝齿棒杆菌厌氧呼吸过程中硝酸盐还原的主要最终产物为有毒的亚硝酸盐。

钝齿棒杆菌(Corynebacteriumcrenatum)是我国学者从土壤中分离的一种无芽孢钝齿状的革兰氏阳性菌，其突变株被广泛应用于国内的各种氨基酸生产中，但对其遗传背景的研究相对较少。

发明内容

本发明的目的是从加强硝酸盐呼吸角度出发，敲除arnR基因及添加硝酸盐加强硝酸盐呼吸强度；引入NirBD基因，将有毒的亚硝酸盐转化为可利用的氨，提高钝齿棒杆菌厌氧条件下发酵产L-精氨酸的产量；为此，本发明首先提供了一种重组钝齿棒杆菌，所述重组钝齿棒杆菌是通过敲除硝酸盐呼吸抑制转录调控因子arnR基因和过量表达大肠杆菌的亚硝酸还原酶基因nirBD得到的。

为实现上述目的，本发明提供一种重组钝齿棒杆菌，所述重组钝齿棒杆菌是以钝齿棒杆菌AS1.542为出发菌株，通过敲除narKGHJI操纵子的转录调控因子arnR基因，并过量表达大肠杆菌的亚硝酸还原酶基因nirBD得到的。

优选的，所述narKGHJI操纵子的转录调控因子arnR基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

优选的，所述过量表达大肠杆菌的亚硝酸还原酶基因nirBD的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

优选的，所述重组钝齿棒杆菌的制备方法包括以下步骤：

(1)通过敲除钝齿棒杆菌中敲除narKGHJI操纵子的转录调控因子ArnR基因arnR，成功构建了钝齿棒杆菌株ΔarnR；

(2)以大肠杆菌DH5α的基因组DNA为模板，将编码亚硝酸还原酶的基因nirBD与穿梭型载体pXMJ19成功连接，获得重组质粒pXMJ19-nirBD；

(3)将重组质粒pXMJ19-nirBD电转入钝齿棒杆菌株ΔarnR，得到重组菌ΔarnR/pXMJ19-nirBD，将重组菌ΔarnR/pXMJ19-nirBD进行厌氧发酵。