[发明专利]一种可视化定量标记细胞中聚集型功能蛋白的方法

说明书

本发明涉及生物探针和蛋白检测技术领域，提供了一种可视化定量标记细胞中聚集型功能蛋白的方法，通过构建和表征聚集诱导发光探针AIE‑cRGD，测定探针AIE‑cRGD的吸收峰和荧光发射峰以及适用浓度，检测确定探针的靶向蛋白为整联蛋白αvβ3，基于poly‑HEMA铺板法建立悬浮存活细胞模型，诱导悬浮存活细胞模型内细胞在脱离粘附的环境下生长，模拟细胞的抗凋亡状态，利用探针标记细胞中的整联蛋白并进行成像，当整联蛋白内化进入内涵体后，确定整联细胞在脱离粘附细胞内的分布情况，检测磷酸化粘着斑激酶p‑FAK与活化整联蛋白在内涵体上的共定位，确定细胞的抗凋亡能力。本发明可直接用于活细胞的染色，为生理功能的可视化奠定了基础，有利于高品质成像及高灵敏度的在线传感监测。

技术领域

本发明涉及生物探针和蛋白检测技术领域，具体涉及一种可视化定量标记细胞中聚集型功能蛋白的方法。

背景技术

整联蛋白广泛分布于细胞表面，由α和β两种亚基组成跨膜异二聚体，是一类跨膜受体糖蛋白，其配体主要为细胞外基质(ECM)蛋白，如玻璃体结合蛋白、层粘连蛋白等。整联蛋白大都有较长的胞外结构域、跨膜区和较短的胞质结构域，其不同结构域具有不同的功能。对胞外结构域而言，它可通过识别细胞外基质蛋白的特定序列即精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD序列)与细胞外基质连接，介导细胞与细胞外基质、细胞与细胞之间的粘附信号；而胞质结构域与细胞骨架结合，形成细胞外基质-整联蛋白-细胞骨架跨膜复合体，参与细胞内外信号的双向传导，调节细胞的存活、增殖及肿瘤的侵袭转移等，通过研究整联蛋白的结构功能及表达调控，能够进一步了解细胞粘附作用的发生及其相关信号的调控。

研究表明整联蛋白通过调控其下游信号分子及途径，包括FAK(Focal AdhesionKinase，局部粘着斑激酶)、Src、ILK(Integrin-linked kinase，整联蛋白连接激酶)、PI3K/Akt、MAPK，调控肿瘤细胞的促存活信号。FAK是一种非受体酪氨酸激酶，作为整联蛋白信号通路下游活化位点分子之一，介导细胞的粘附、迁移、增殖等。FAK内含多个酪氨酸位点，整联蛋白与细胞外基质结合，在与基质形成的粘附位点上，通过β亚基招募FAK，FAK在Y397位点磷酸化，与下游Src激酶形成复合物，激活Src激酶，其他FAK位点磷酸化，激活PI3K-Akt和MAPK-Erk信号通路，抑制细胞凋亡。

2015年，Jonna Alanko等人发现整联蛋白介导促细胞生长信号不只局限于细胞与细胞外基质的粘附位点，还出现在内涵体上。细胞与细胞外基质连接时，整联蛋白可在粘附位点招募下游信号分子FAK，传导整联蛋白介导的信号，细胞失去粘附，整联蛋白内吞进入内涵体，通过内涵体传导整联蛋白介导的细胞生长信号，这就表明除了质膜粘附点，内涵体可作为整联蛋白介导的FAK促细胞生长信号平台，延长依赖细胞外基质的存活信号，维持肿瘤细胞的存活。已有研究证实整联蛋白内吞作用可促进内涵体上FAK磷酸化，内涵体上磷酸化的FAK信号，可以抑制肿瘤细胞凋亡，支持肿瘤细胞的非锚定性生长，促进肿瘤转移。因此，通过检测内化进入内涵体的活化整联蛋白束标记建立在内涵体上的p-FAK信号平台，能够检测细胞脱粘附后的存活能力。

荧光成像作为直观、原位的检测技术，可用于检测分子的表达和分布。目前，对于整联蛋白的研究多集中于通过抗体孵育表达进行成像分析，传统的有机荧光分子浓度高，在聚集状态下会发生聚集诱导淬灭(ACQ)效应，使用过程中需要合理控制荧光分子的工作浓度，大大限制了其适用范围。

聚集诱导发光(AIE)分子作为一种特殊的荧光分子，其内含有的活跃基团进行相对运动(例如振动和转动)，使得处于激发态的分子通过相对运动的形式将光能转化为热能等形式消耗，以光形式输出能量的比例较低；AIE分子聚集，限制了分子的相对运动，大幅度提高了能量以光能形式输出的比例，从而表现出荧光增强的现象，甚至发生由由暗到明的突跃，实现对诱导源可视化的定性分析和定量检测，因此，聚集诱导发光(AIE)分子为生物大分子生理功能的可视化提供了可能，有利于高品质的成像及高灵敏度的在线传感监测。

发明内容