[发明专利]一种可视化定量标记细胞中聚集型功能蛋白的方法

权利要求书

1.一种可视化定量标记细胞中聚集型功能蛋白的方法，其特征在于，采用聚集诱导发光探针AIE-cRGD，具体包括以下步骤：

步骤1，聚集诱导发光探针AIE-cRGD的构建和表征

将1,2-二(4-羧基苯)-1,2-苯乙烯和cRGD按照相同摩尔比混合，再加入催化剂EDC-NHS进行催化，反应得到聚集诱导发光探针AIE-cRGD，配制由二甲基亚砜和水组成的测试体系，在该测试体系中测定聚集诱导发光探针AIE-cRGD的紫外吸收光谱和荧光光谱，确定聚集诱导发光探针AIE-cRGD的吸收峰和荧光发射峰；

步骤2，确定聚集诱导发光探针AIE-cRGD的浓度

改变聚集诱导发光探针AIE-cRGD的浓度，利用细胞计数试剂CCK-8检测不同聚集诱导发光探针AIE-cRGD浓度条件下的细胞活性，确定聚集诱导发光探针AIE-cRGD用于活细胞成像的适用浓度；

步骤3，检测聚集诱导发光探针AIE-cRGD的靶向蛋白

分别将牛血清白蛋白BSA、胰蛋白酶Trypsin、谷氨酰胺Glutamine、半胱氨酸Cysteine、胱氨酸Cystine、基质金属蛋白酶MMP9和整联蛋白αvβ3稀释至100μg/mL，将聚集诱导发光探针AIE-cRGD的浓度稀释至适用浓度范围内，再分别将各蛋白溶液与聚集诱导发光探针AIE-cRGD按照1:1的体积比加入至300μL磷酸缓冲盐溶液中混合，针对各蛋白溶液，测定聚集诱导发光探针AIE-cRGD在吸收峰处的紫外吸收程度，确定整联蛋白αvβ3为聚集诱导发光探针AIE-cRGD的靶向蛋白，能够利用聚集诱导发光探针AIE-cRGD对细胞中的整联蛋白进行染色；

步骤4，基于poly-HEMA铺板法建立悬浮存活细胞模型，诱导悬浮存活细胞模型内细胞在脱离粘附的环境下生长，模拟细胞的抗凋亡状态；

步骤5，在悬浮存活细胞模型中，利用聚集诱导发光探针AIE-cRGD标记细胞的整联蛋白并进行成像，当整联蛋白内化进入内涵体后，确定整联蛋白在脱离粘附细胞内的分布情况，检测磷酸化粘着斑激酶p-FAK与活化整联蛋白在内涵体上的共定位，确定细胞的抗凋亡能力。

2.如权利要求1所述的一种可视化定量标记细胞中聚集型功能蛋白的方法，其特征在于，所述聚集诱导发光探针AIE-cRGD内含有聚集发光分子和靶向整联蛋白的多肽。

3.如权利要求1所述的一种可视化定量标记细胞中聚集型功能蛋白的方法，其特征在于，所述步骤1中，测试体系中二甲基亚砜和水的比例为1:100。

4.如权利要求1所述的一种可视化定量标记细胞中聚集型功能蛋白的方法，其特征在于，所述步骤2中，分别将聚集诱导发光探针AIE-cRGD的浓度调整为1μg/mL、10μg/mL、50μg/mL和100μg/mL。

5.如权利要求1所述的一种可视化定量标记细胞中聚集型功能蛋白的方法，其特征在于，所述步骤5中，基于MATLAB软件编制定量多参数图像分析平台，通过将图像分割，确定悬浮存活细胞模型内各内涵体的形态和位置。

6.如权利要求1所述的一种可视化定量标记细胞中聚集型功能蛋白的方法，其特征在于，所述步骤5中，磷酸化粘着斑激酶p-FAK随整联蛋白的增加而增加，聚集诱导发光探针AIE-cRGD的荧光强度显示了整联蛋白的活化情况，用于检测整联蛋白介导的内涵体p-FAK信号平台。

7.如权利要求1所述的一种可视化定量标记细胞中聚集型功能蛋白的方法，其特征在于，所述步骤5中，聚集诱导发光探针AIE-cRGD与磷酸化粘着斑激酶p-FAK之间荧光强度的关系为N(p-FAK)＝186.06+0.16N(AIE-cRGD)，其中，N(p-FAK)表示磷酸化粘着斑激酶p-FAK的荧光强度，N(AIE-cRGD)表示聚集诱导发光探针AIE-cRGD的荧光强度。