[发明专利]一种同时检测多种目标物的生化分析方法

说明书

本发明公开了一种同时检测多种目标物的生化分析方法，该方法将生化反应与可视化微球计数、机器视觉与深度学习相结合，将与待测目标物对应的生物识别分子分别偶联在载体和信号探针表面，进行免疫反应或者DNA分子杂交反应，然后根据载体和信号探针粒径大小的不同，使用毛细管或复合膜对其进行分离，最后直接对分离后的信号探针进行光学显微成像计数，本发明通过使用不同粒径或颜色的信号探针用于区分不同的检测对象，最终实现了多种目标物的同时检测。

技术领域

本发明属于生化分析领域，涉及一种同时检测多种目标物的生化分析方法。

背景技术

随着国家发展与人民生活水平提高，食品安全、体外诊断和环境监测等领域所面临的挑战与日俱增，高效的检测手段在保障食品安全、促进人类健康、生态环境安全等方面都具有极其重要的影响。传统检测方法大多都依赖于大型精密仪器设备，虽然具有精度高、准确性好等特点，但是大部分仪器造价昂贵且携带不便，使用前需要对检测样品进行复杂的前处理，对使用仪器设备的人员也有较为严格的要求。

基于抗体-抗原识别反应的免疫分析方法在食品安全和体外诊断领域应用广泛。传统的酶联免疫吸附法(ELISA)具有灵敏度高、成本低等优点，但整个实验操作繁琐且耗时长，不能实现对同一样品中的多个目标物同时检测；胶体金试纸条法操作简便且检测速度快，但灵敏度比较低，仅适用于定性分析或半定量分析；荧光免疫检测法检测精度高、速度快，对多目标物检测具有良好的适应性，但检测所需仪器设备造价昂贵，且荧光试剂需要避光稳定性较差。

采用高分子微球作为信号探针，将颗粒计数和免疫分析相结合，能够实现高灵敏下的准确检测。目前颗粒计数已有多种实现方式，例如申请人前期研究中使用的库尔特小孔颗粒电阻法和差分阻抗法等，但是小孔颗粒电阻计数器造价昂贵，而且小孔管容易发生堵塞，相比之下，光学显微成像法能够直接读取颗粒数量，因此检测成本更低，操作也更加便捷。例如CN 109521202A公开了一种基于数字免疫分析的蛋白质定量方法，该方法将捕获磁珠、目标抗原和检测颗粒进行免疫反应，形成免疫复合物，然后将免疫复合物中的检测颗粒洗脱并转移至微流控颗粒计数芯片，检测颗粒沉积固定在芯片上，对所有固定在芯片上的检测颗粒进行成像记录，统计芯片上检测颗粒的数量，即得到目标蛋白的分子数。该方法实现了疾病相关蛋白质的超灵敏、绝对定量分析，但是无法实现对多种目标物的同时检测。另外，该方法需要进行多次磁分离，并且需要加入酸性溶液将免疫复合物中的检测颗粒洗脱下来，多步的磁分离及洗涤过程不仅降低了分析效率，而且容易造成累积误差。

发明内容

为解决上述问题，本发明提出了一种同时检测多种目标物的生化分析方法，该方法将生化反应与可视化微球计数、机器视觉与深度学习相结合，将与待测目标物对应的生物识别分子分别偶联在载体和信号探针表面，进行免疫反应或者DNA分子杂交反应，然后根据载体和信号探针粒径大小的不同，使用毛细管或复合膜对其进行分离，最后直接对分离后的信号探针进行光学显微成像计数，本发明通过使用不同粒径或颜色的信号探针用于区分不同的检测对象，最终实现了多种目标物的同时检测。

上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种同时检测多种目标物的生化分析方法，包括以下步骤：

1)以不同粒径和/或不同颜色的高分子微球为信号探针，将多种目标物的生物识别分子分别与不同粒径和/或不同颜色的信号探针偶联，每一种粒径和/或颜色对应一种目标物，同时以另一种大粒径的高分子微球为载体，将多种目标物对应的生物识别分子分别与载体偶联，将偶联有生物识别分子的信号探针和载体同时加入到待测样品进行生化反应；

2)将反应液通过毛细管或复合膜进行分离，收集含有未参与反应的信号探针的分离液；

3)将分离液滴加到划分网格的载玻片上，涂匀后盖上玻片，光学显微镜对焦后对不同网格的计数区域进行分别拍照，并将高清图像传送至计算机；