[发明专利]一种混合精斑提取工艺

权利要求书

1.一种混合精斑提取工艺，其特征在于，所述混合精斑提取工艺包括：

对检材进行一次裂解，收集一次沉淀，对一次沉淀进行二次裂解，收集二次沉淀，对二次沉淀进行三次裂解，收集上清液，获得含有男性DNA的溶液；

所述混合精斑提取工艺包括以下步骤：

(1)将检材与包括Tris-Cl、氯化钠和十二烷基硫酸钠的裂解液于50～60℃混合20～40min，离心，收集沉淀；

(2)将步骤(1)得到的沉淀与清洗液混合，离心，收集沉淀；

(3)将步骤(2)得到的沉淀与包括Tris-Cl、氯化钠、乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸钠、Triton-X 100、脱氧胆酸钠、氯化镁和氯化钙的裂解液于50～60℃混合20～40min，离心，收集沉淀；

(4)将步骤(3)得到的沉淀与清洗液混合，离心，收集沉淀；

(5)将步骤(4)得到的沉淀与包括Tris-Cl、氯化钠、十二烷基硫酸钠、盐酸胍、二硫苏糖醇和柠檬酸钠的裂解液混合，离心，收集上清液，获得含有男性DNA的溶液；

步骤(1)所述Tris-Cl在所述裂解液中的浓度为90～110mM，所述氯化钠在所述裂解液中的浓度为9～11mM，所述十二烷基硫酸钠在所述裂解液中的质量百分比为1％～3％；

步骤(3)所述Tris-Cl在所述裂解液中的浓度为90～110mM，所述氯化钠在所述裂解液中的浓度为18～22mM，所述乙二胺四乙酸在所述裂解液中的浓度为9～11mM，所述十二烷基硫酸钠在所述裂解液中的质量百分比为0.5％～1.5％，所述Triton-X 100在所述裂解液中的质量百分比为0.25％～0.75％，所述脱氧胆酸钠在所述裂解液中的质量百分比为0.25％～0.75％，步骤(3)所述氯化镁在所述裂解液中的浓度为18～22mM，所述氯化钙在所述裂解液中的浓度为9～11mM；

步骤(5)所述Tris-Cl在所述裂解液中的浓度为90～110mM，所述氯化钠在所述裂解液中的浓度为90～110mM，所述十二烷基硫酸钠在所述裂解液中的质量百分比为0.5％～1.5％，所述盐酸胍在所述裂解液中的浓度为2～6mM，所述二硫苏糖醇在所述裂解液中的浓度为3～7mM，所述柠檬酸钠在所述裂解液中的浓度为45～55mM；

所述清洗的清洗液包括Tris-Cl、氯化钠和乙二胺四乙酸，所述Tris-Cl在所述清洗液中的浓度为90～110mM，所述氯化钠在所述清洗液中的浓度为18～22mM，所述乙二胺四乙酸在所述清洗液中的浓度为9～11mM。

2.根据权利要求1所述的混合精斑提取工艺，其特征在于，所述混合精斑提取工艺在全自动移液工作站中进行。

3.根据权利要求1所述的混合精斑提取工艺，其特征在于步骤(5)所述混合的温度为50～60℃，所述混合的时间为20～40min。

4.根据权利要求1所述的混合精斑提取工艺，其特征在于，所述混合精斑提取工艺还包括纯化DNA的步骤。

5.根据权利要求4所述的混合精斑提取工艺，其特征在于，所述纯化包括使用磁珠吸附DNA，并进行清洗和洗脱，得到纯化的DNA。

6.根据权利要求5所述的混合精斑提取工艺，其特征在于，所述吸附的结合液包括异丙醇。

7.根据权利要求6所述的混合精斑提取工艺，其特征在于，所述异丙醇的体积分数为80％～90％。

8.根据权利要求5所述的混合精斑提取工艺，其特征在于，所述洗脱的洗脱液包括Tris-Cl、氯化钠和乙二胺四乙酸。

9.根据权利要求1-8任一项所述的混合精斑提取工艺，其特征在于，所述混合精斑提取工艺包括以下步骤：

(1)在全自动移液工作站中，移液泵将包括Tris-Cl 90～110mM、氯化钠9～11mM和十二烷基硫酸钠1％～3％的裂解液加入到检材中混合，50～60℃孵育20～40min，机械夹手将混合液移至离心机进行离心，收集沉淀；

(2)移液泵将步骤(1)得到沉淀与包括Tris-Cl 90～110mM、氯化钠18～22mM和乙二胺四乙酸9～11mM的清洗液混合，机械夹手将混合液移至离心机进行离心，收集沉淀；

(3)移液泵将步骤(2)得到沉淀与包括Tris-Cl 90～110mM、氯化钠18～22mM、乙二胺四乙酸9～11mM、十二烷基硫酸钠0.5％～1.5％、Triton-X 1000.25％～0.75％、脱氧胆酸钠0.25％～0.75％、氯化镁18～22mM和氯化钙9～11mM的裂解液混合，50～60℃孵育20～40min，机械夹手将混合液移至离心机进行离心，收集沉淀；

(4)移液泵将步骤(3)得到沉淀与包括Tris-Cl 90～110mM、氯化钠18～22mM和乙二胺四乙酸9～11mM的清洗液混合，机械夹手将混合液移至离心机进行离心，收集沉淀；

(5)移液泵将步骤(4)得到沉淀与包括Tris-Cl 90～110mM、氯化钠90～110mM、十二烷基硫酸钠0.5％～1.5％、盐酸胍2～6mM、二硫苏糖醇3～7mM和柠檬酸钠45～55mM的裂解液混合，50～60℃孵育20～40min，机械夹手将混合液移至离心机进行离心，收集上清液，获得含有男性DNA的溶液；

(6)移液泵将步骤(5)得到的含有男性DNA的溶液和体积分数为80％～90％的异丙醇溶液转移至结合板，机械夹手将结合板转移至磁吸板位进行磁珠吸附，随后移液泵将结合板中的溶液吸出并弃掉；

(7)移液泵将包括Tris-Cl、NaCl、盐酸胍、异丙醇和乙醇的清洗液加入步骤(6)吸附后的结合板中进行清洗，随后进行磁珠吸附并弃掉清洗液；

(8)移液泵将乙醇加入步骤(7)吸附后的结合板中进行清洗，随后进行磁珠吸附并弃掉清洗液；

(9)移液泵将包括Tris-Cl、氯化钠和乙二胺四乙酸的洗脱液加入步骤(8)吸附后的结合板中进行洗脱，收集洗脱液，得到纯化的男性DNA。